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Sep 15, 2023

微小潅流とイン

Rapporti scientifici Volume 5,

Scientific Reports volume 5、記事番号: 18095 (2015) この記事を引用

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6 引用

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

現在、分光計は哺乳類細胞の可視化に必要な磁場強度を提供していますが、生きた組織の画像化に対応するように設計されていません。 そのため、分光計は生体組織での実験を行う上で重大な課題をもたらしますが、その中で最も明白なのは空間的な制限です。 この制限は、かさばり、ほぼ光学顕微鏡または電気生理学研究専用に設計されている市販の灌流装置を使用しようとする場合に問題になります。MR 互換性が設計基準として含まれることはほとんどありません。 空間的アクセスが制限された超高磁場環境特有の問題を克服するために、我々は、Bruker のマイクロ表面コイル シリーズと接続できるマイクロ灌流およびボア内酸素化システムを設計しました。 これらのデバイスは、切除された生体組織の MR 研究における細胞解像度イメージングをサポートするように設計されています。 組み合わせたシステムにより、灌流液中の溶存ガスと pH レベルの両方を正確に制御できるため、幅広い種類の組織に適用できることが実証されています。 そのコンパクトさ、線形アーキテクチャ、および MR 互換の材料コンテンツは、あらゆる NMR 分光計と互換性のある多用途のハードウェア インターフェイスを提供することを目的とした重要な設計機能です。 このような特性により、現在開発中のシステムに加えて、多数の最新の NMR システムでも使用できるため、微量灌流リグの継続的な実用性が保証されます。

病気の治療効果の増加と病気の発症と治療適用の間の時間間隔の短縮との相関関係については、十分に説明され確立された臨床現象があります 1,2,3。 残念なことに、現代の診断のほとんどは、臨床医が診断と治療を行う前に、患者が病気の症状を自己報告することに依存しています。 このため、患者が必要な治療を受ける前に、無症候性の疾患が発症する期間が大幅に長くなることがよくあります。

バイオマーカーアッセイは、疾患の早期検出が可能で、発症から治療までの時間を短縮できる非常に高感度なスクリーニングツールを提供すると約束されていますが、そのようなツールは一般に、生体内での組織病理の空間的特徴に関する情報をほとんど提供しません。 臨床医は、診断の確認、治療後の疾患モニタリング、腫瘍切除の外科的計画などのさまざまな用途で、健康な組織と不健康な組織を区別できなければならないため、患者のケアの場合、病変組織の空間的特徴に関する正確な情報は簡単ではありません4。 。 あるいは、組織固有の空間情報を提供できる診断方法（組織生検後の分子標識など）は、多くの場合、空間データの範囲が限定されすぎて、繰り返し測定したり、特定の組織を調査したりすることができず、二次感染を引き起こすことが多すぎます。回復を複雑にする、または妨げる5. 近年、二次感染が再燃しており、特に前立腺生検の場合は、おそらく術後の抗生物質の有効性が低下し続けていることが原因と考えられます6,7。

明らかに、患者の健康を改善するためのいずれかの方法論の可能性を最大限に発揮するには、臨床画像法が疾患検出の分子的方法の改善と併せて開発されなければなりません。 健康な組織と病気の組織の両方の MR 特性を細胞レベルで特定することにより、そのような初期段階 (多くの場合無症候性) の疾患状態が MR 信号とコントラスト特性にどのような影響を与えるかについての洞察が得られます。 したがって、組織の微細構造は現在、臨床で直接観察することはできず、今後もアクセスできない可能性がありますが、特定の疾患状態が微小環境内の MR コントラストパラメータにどのような影響を与えるかを完全に理解することは、顕微鏡レベルで病理学的変化がどのように発生するかを理解することにつながります。臨床スキャンで自分自身を表現します。 このような細胞分解能データ (等方性 10 μm 未満) は、関連する物理スケールで MR コントラスト パラメータを定量化できる唯一のシステムである超高磁場イメージング装置を使用して収集する必要があります。 したがって、健康な組織および病気の組織の特性評価研究に使用するために、哺乳動物の細胞構造を解析できるMRイメージングシステムが現在必要とされています。

哺乳動物の細胞構造に関する予備的な MR 画像研究は、細胞解像度のスキャンを行うには長い収集時間が必要であるため、固定組織サンプルのみで行われてきました 8,9。 これらの実験条件は、長時間のイメージング実験の過程でサンプルの安定性を確保するために必要でしたが、固定液は組織の浸透特性、膜透過性、緩和特性を変化させることが知られているため、このような条件は理想的ではありません10、11、12、13。

生体組織外植片に対して行われる MR 顕微鏡研究は伝統的に、解像度が低い (つまり非細胞) という問題に加え、単離された組織部位の灌流液状態の制御が不正確であるという問題に悩まされてきました。 細胞構造を直接視覚化できない問題は、その後、高周波 (RF) マイクロコイル技術の大幅な改善によって克服されました 14、15、16、17、18、19、20、21、22。 しかし、MR マイクロイメージング実験中に灌流液の状態を効果的に制御する能力については、十分に対処されていません。 外植片研究では、灌流デバイスを何度も繰り返し使用でき、サンプル条件の優れた制御や、代謝産物の送達を改善するためのマイクロニードルアレイなどの革新的な機能を提供します23、24、25、26。 しかし、最新の灌流システムの主な欠点は、開発のコンセプトおよび設計段階で MR 互換性が欠如していることです。 その結果、超高磁場スキャナを使用する際に課される空間的制限と材料的制限の両方を考慮すると、既存の MR イメージング システムと接続できるようにそのようなデバイスを変更することは、非常に非現実的です。

生きた外植片で使用する信頼性の高い MR 互換の微量灌流ハードウェアのニーズに応えるために、当社は細胞分解能研究での使用に特化した組織保持/灌流システムを設計および製造しました。 プロトタイプ システムは、改良された市販のマイクロ表面コイル (Bruker Biospin、B6370) に接続されます。 詳細な回路図と製造手順に加えて、人工脳脊髄液 (aCSF) の溶存酸素含有量と pH、およびボア内人工肺を使用した実験における経時的な MR 信号の安定性を定量化したテストの結果を報告します。 溶存ガスと pH の定量化の場合、ボア内人工肺を使用したテストの結果が、以前の設計の外部膜型人工肺装置を使用した同等の実験と比較されます27。

直径 500 μm のマイクロ表面コイル (Bruker Biospin、Z76409) を、マイクロ灌流リグと接続するように修正しました。 コイルのプラスチックアセンブリの背面にチャネル (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D) を作成しました。 2 つのナイロン スペーサー (長さ 6 mm × HT 4 mm、幅 0.5 mm) をチャネルの側面に接着し、コイルの半円形の輪郭までやすりで削りました。 2 つのより狭い両側の溝 (3 mm HT × 1.5 mm D) を、コイル アセンブリの周囲に巻き付くまでチャネルから延長しました。 コイルアセンブリの上部の幅方向の中央に、チッププレートのすぐ後ろに位置する穴（直径2mm×深さ14mm）をドリルで開けました。

高ガス保持灌流ライン (Cole-Parmer、06508-13) をガス注入灌流液リザーバーと人工肺の間に使用しました。 外部人工肺または灌流装置のセットアップでは、このラインは人工肺と灌流の橋渡しにもなります。 蠕動ポンプ (Masterflex L/S、7519-20) によって灌流 (2 ml/分) が行われました。 灌流チャンバー (容積 150 μm) の場合、アセタール ロッドを単一の開放端構成 (外径 9.5 mm、長さ 6 mm、内径 6 mm) に機械加工しました。 開口端は、シリコン シーラントを使用して接着されたシリコン ガスケット (Amazon、ORS-009-25) を収容するために 30° 面取りされています。 ケーブルタイ (Thomas & Betts、SF100-18) を収容するために、水平チャネル (2.5 mm HT × 1 mm D) を灌流ウェルの閉鎖端にフライス加工しました。 流入ラインと流出ライン (Cole-Parmer、S-06418-02) はウレタンで所定の位置に保持され、乱流を最大化し、代謝物勾配を最小化するためにウェルの内部でオフセット (3 mm) されました。 ナイロン保持リング (外径 5 mm、内径 4 mm、厚さ 300 μm) とメッシュ (直径 4 mm、窓 2 mm × 1.5 mm、孔径 50 μm) をナイロンワッシャー (Amazon、B00DHVBPOO) から手作業で作成しました。ナイロン織シート (Amazon、CMN-0053-C)。

直径 5 mm の NMR 管 (Wilmad、WG-1000-7) を改造して長さ 16.5 cm のガラスパイプにし、ガス入口 (内部) チャンバーとして機能させました。 カーボゲン供給ラインを収容するために、5 mm チューブ キャップの上部に穴 (直径 1.5 mm) が開けられました。 次に、10 mm NMR サンプル チューブ (Wilmad、513-1 PP-7FB) を長さ 18 cm のガラス パイプに改造して、ガス交換 (外部) チャンバーを形成しました。 5 mm チューブ アセンブリを入れ子にするために、10 mm チューブのキャップの中心に穴 (直径 6 mm) が開けられました。 10 mm チューブのキャップの上部に 2 つの追加の穴 (直径 1 mm) を開けました。 1 つは交換膜入口として機能し、もう 1 つは入ってくるカーボゲンを排出するために開いたままになっています。 シリコン交換チューブ (HelixMark、60-011-03) を上部の 10 mm チューブ キャップを通して導入し、ガス交換コンパートメント内の入れ子になった 5 mm チューブの周りにしっかりと巻き付け、人工肺にある 2 番目の 10 mm NMR チューブ キャップを通過させました。ベース。 このキャップには、ウレタンで所定の位置に保持されたアセタール ペグ (20 mm HT、直径 2 mm) が中央に収納されていました。 外部に露出したガス交換チューブの長さは、1/16 インチ ナイロン カプラー (Eldon James Corp.、C0-1 NN) を介して灌流ライン (Cole-Parmer、S-06418-02) に接続された 2 つの 10.0 mm セグメントに最小限に抑えられ、わずかに高い出力を実現しました。人工肺の底部から出る灌流ラインは、灌流チャンバーの流入ラインに直接接続され、下部の 10 mm NMR チューブ キャップは、膜交換のために人工肺装置の内部にアクセスする手段としてウレタンなしで取り付けられました。

aCSF 灌流液 (120 mM NaCl、26 mM NaHCO3、1.5 mM KH2PO4、1.4 mM MgSO4・7 H2O、2 mM CaCl2・2 H2O、3 mM KCl、10 mM グルコース; 浸透圧 = 300 mOsm) の溶存酸素パーセントの測定値を収集しました。体積制限微小電極プローブ (Microelectrodes Inc.、MI-730) に接続された酸素メーター (Microelectrodes Inc.、OM-4) を使用します。 溶存酸素測定値は、95% O2、5% CO2 カルボゲン (ポジティブ コントロール) で直接バブリングされた灌流液リザーバーから、またはボア内人工肺には、さまざまな酸素含有量 (周囲空気、95%、60%、および 19%) のガスが供給されました。 ボア内人工肺の機能と外部膜型人工肺の機能を比較するために、リグ中にカーボゲンガス (95% O2、5% CO2) が供給された外部人工肺装置を使用しながら、灌流チャンバー内で追加の測定 (n = 10) が行われました。操作（2ml/分）。

aCSF 灌流液の pH 測定値は、低容量サンプル プローブ (Mettler Toledo、6030-02-BNC) に接続された Accumet Basic pH メーター (Fisher Scientific、AB15) を使用して評価されました。 測定は、外部またはボア内の膜型人工肺のいずれかに接続された操作用灌流リグ (2 ml/分) を備えた灌流液ウェル (n = 8) で行われました。 aCSF リザーバーはカーボゲンガス (95% O2、5% CO2) で直接バブリングされ、同時に同じガス混合物が外部とボア内の両方の人工肺に供給されました。 8 つの試験の結果を平均し、両方の治療グループの平均を目標の生理学的 pH 範囲 (7.3 ～ 7.4) と比較しました。

すべてのイメージングは​​、マイクロイメージング勾配 (Bruker Biospin; Micro 5) を備えた 600 MHz 分光計 (Oxford) で実行されました。 サンプル温度 (23 °C ± <1 °C) は、熱電対から分光計のボアを流れる空気の温度を制御するチラー ユニット (Bruker、BCU II -80/60) へのフィードバック ループを使用して連続的に測定され、一定に保たれました。 すべてのデータは、拡散強調スピン エコー シーケンスを使用して収集されました。 拡散強調は b = 1200 s/mm2 で一定に保たれました。これは、利用可能なスキャン時間内で組織の変化に対する十分な感度と適切な信号対雑音比 (400 ～ 500 の典型的な SNR) を提供するための妥協案です。 データ分析は、統計ツールボックス (Microsoft Excel) および Matlab® を使用してオフラインで実行されました。 14 回の連続した拡散強調スピン エコー スキャン (TR/TE = 2000/11.64 ms、b = 1200 s/mm2、Res = 31.25 μm 等方性、持続時間 = 1.5 時間、平均 = 42) を収集し (n = 3)、シグナルを比較しました。経時的な安定性 (合計 21 時間)。 均一なフィールド条件を確保するために手動シミングが採用されました28。 シム設定は、ボア内人工肺の有無の両方で観察された水信号ピークの 1/2 高さ（通常 35 Hz 以下）の線幅の測定値を使用して評価されました。つまり、装置の使用は検出可能な磁場の不均一性を引き起こしませんでした。 2 つの実験グループのそれぞれで同一のイメージング プロトコルを使用しました。1 つのシリーズは連続灌流 (2 ml/分) を使用し、もう 1 つのシリーズは灌流なし (安定したコントロール) でした。 14 の各時点で撮影された 3 つの画像からの生の拡散信号読み取り値 (関心領域全体の平均信号強度として取得) を平均し、時間の関数としてプロットして、21 時間の実験にわたるグループ内の信号変動を評価しました。 治療群間の統計的比較は、同等性検定を使用して実施されました。 同等の範囲（平均+/-9％）は、研究の時間経過にわたって非灌流（すなわち、安定した静的対照群）で観察されたグループ内シグナル変化の合計に基づいて決定した。 安定性試験のための両方のイメージング データセットは、観察された拡散信号変化の考えられる原因としての形態学的サンプルの変化を排除するために、固定されたマウス皮質 (厚さ 300 μm) で実行されました。

ラットからの急性皮質切片 (n = 4、厚さ 300 μm) を、微小灌流リグに導入する前に、連続ガス (95% O2、5% CO2) を供給した 4 °C aCSF 槽内でビブラトームを介して単離しました。 イメージングの前に、サンプルを 1 時間連続灌流下で 23 °C に順応させました。 拡散強調画像 (TR/TE = 2000/11.6 ms、b = 1200 s/mm2、Res = 31.25 μm 等方性) を長短の撮像間隔で収集しました (継続時間 = 1.5 時間、平均 = 42、継続時間 = 4 分、平均) = 2) 灌流条件の変化あり (連続 = 21.5 時間のタイムコース全体で灌流をオンにして 1.5 時間のスキャン; 断続 = データ収集中は灌流をオフにして、その間の 10 分間の灌流間隔でオンにして 1.5 時間のスキャン; 長い間隔/長いスキャン =データ収集中は灌流をオンにして、スキャン間の 10 分間はオフにして 1.5 時間のスキャン; 長い間隔/短いスキャン = 灌流をオフにして 4 分間のスキャンを実行し、灌流をオンにして 1.5 時間の間隔を挟みます)。 非灌流皮質データは、リグに配置された生きた急性スライスで生成され、イメージ化されました (TR/TE = 2000/11.6 ms、b = 1200 s/mm2、Res = 31.25 μm 等方性、持続時間 = 1.5 時間、平均 = 42)。 aCSF灌流液交換の非存在下での15.5時間の時間経過。 同様に、安定したコントロール データは、灌流がない状態で同一のイメージング パラメーターを使用し、18.5 時間の時間経過にわたって固定スライスを使用して生成されました。 拡散シグナル強度 (任意の単位)​​ は、実験グループに応じて 15.5 時間から 21.5 時間続く時間経過にわたって記録されました。

マイクロサーフェスコイルの修正、マイクロ灌流リグアセンブリ、およびボア内人工肺装置の詳細な概略図が提供されます（図1および2）。 外部およびボア内人工肺アタッチメントの両方を備えたリグ アセンブリのブロック図も示されています (図 3)。

個々の微小灌流リグのコンポーネントの詳細を示す分解図。

(a) アセタールロッドから機械加工された灌流液ウェル (容量 150 μl、外径 9.5 mm、LN 6 mm、内径 6 mm)。 開放端側 (....) は、シリコン ガスケットの取り付けに対応するために垂直から 30 度の角度で面取りされています。 閉じた側には水平チャネル (2.5 mm HT × 1 mm D) が含まれており、その中に薄型ケーブル タイ (Thomas & Betts、SF100-18) (図には示されていません) が配置され、灌流チャンバーを密閉する非永続的な手段として機能します。 流入ラインと流出ライン (Cole-Parmer、S-06418-02) は灌流ウェルの上部から入り、外側に塗布された高剥離強度ウレタンで所定の位置に固定されています。 (b) 灌流ウェルと組織ウェルの間の液密ガスケットとして機能するシリコン O リング (Amazon、ORS-009-25)。 水族館に安全なシリコーンシーラントを使用して灌流ウェルに固定されています。 (c) 平らなナイロンワッシャー (Amazon、B00DHVBPOO) から手作業で形成されたナイロン保持リング (外径 5 mm、内径 4 mm、壁 0.5 mm、厚さ 300 μm)。 板金パンチを使用して内径を 3.97 mm まで広げました。 金属ヤスリを使って厚みを削りました。 最後に、組織ウェルに挿入する前に圧縮できるように、メスでリングにノッチ (2 mm) を切り込みました。 (d) 保持メッシュの構築には、孔径 50 μm の織ナイロン (Amazon、CMN-0053-C) を使用しました。 シートから円板（直径 4 mm）を切り出し、コイル面と重なる中央部分から窓（2 mm × 1.5 mm）を切り出しました。 この窓は、コイルと接触しているサンプル領域を明確に観察できるようにすることで組織の配置を支援し、ナイロンがコイルの励起プロファイルに入るのを防ぎました。 (e) 厚さ 300 μm の組織スライス (写真は海馬) を表面コイルと直接接触させて配置し、メッシュ インサートと保持リングを使用して垂直に吊り下げます。 (f) 4 ターンのマイクロ表面コイル (直径 500 μm) は、直径 5 mm の底部に描かれています。 ティッシュもしっかり。 コイルアセンブリの追加のコンポーネント (リード、コンデンサ、プラスチックベースなど) は示されていません。

改良された 500 μm マイクロコイルの写真とボア内人工肺の詳細な概略図。

(a) マイクロコイル アセンブリの背面図。フライス加工されたチャネル (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D) の両側にナイロン スペーサー (6 mm LN × 4 mm HT × 0.5 mm W) が配置されており、低周波電流をキャッチします。プロファイル ケーブル タイ (Thomas & Betts、SF100-18)。 (b) 両側の溝を詳細に示すマイクロコイルの正面図 (3 mm HT × 1.5 mm D)。 切り欠きにより、灌流ウェルを可逆的に密閉するために使用されるケーブルタイ用のクリアランスが提供されました。 (c) コイル アセンブリの上面図。 穴 (直径 2 mm × 奥行き 14 mm) には、ボア内人工肺のアセタール製サポート ペグが取り付けられます。 (d) ボア内人工肺装置の詳細な概略図 (入れ子型、開放端 5 mm & 10 mm NMR チューブ、高さ 19 cm x 幅 1 cm)。 インラインバブルトラップを通過した後、aCSF 灌流液は、ガス透過性の高いシリコーンチューブ (HelixMark、60-011-03) を通ってボア内人工肺に流入します。 人工肺装置のガス交換膜を構成するこのチューブ () は、ガス交換が起こる表面積を最大化するために、入れ子になった NMR チューブの内側でしっかりとコイル状に巻かれています。 カルボゲンガスは、5 mm チューブのキャップ上部のポートを通って入り、5 mm チューブの開いた底部を通ってガス交換チャンバー (10 mm NMR チューブ) に入ります ()。 10 mm チューブの上部にベントを配置することで、ガスが人工肺アセンブリから出るときにカーボゲンがコイル状の膜を通過することが保証されます。 カーボゲンで飽和した aCSF は 10 mm チューブの底部キャップを通って出て、灌流チャンバーに入ります。 ガス交換部位と組織灌流部位の間の距離が大幅に減少したこと (ボア内 2 cm 対 外部 500 cm) により、観察されたガス保持特性が大幅に改善されました。 人工 CSF は、分光計の外側にある廃棄物リザーバーに向かう途中で、戻りラインを通ってリグから出ます。 シリコーン膜 () の端を、ナイロン カプラー () (Eldon James、C0-1AGHDPE) を使用して Tygon® ライン () (Cole-Parmer、S-06418-02) に接合しました。

デュアル人工肺構成の微小灌流リグのブロック図。

(a) 外部人工肺のセットアップ。 外部人工肺 (幅 45 cm × 高さ 60 cm × 深さ 30 cm) と灌流チャンバーの間の微小灌流ライン (5 m) (Cole-Parmer、06508-13) が長すぎると、組織に到達する前に aCSF 灌流液が大幅に脱気されます。スライス。 この脱気は、外部人工肺セットアップで灌流チャンバー内で記録された低酸素 (O2 損失) および高 pH (CO2 損失) 状態の原因であり、高いガス保持のために設計された灌流ラインを使用したにもかかわらず発生しました。 (b) ボア内の人工肺のセットアップ。 微小灌流リグの膜型人工肺 (高さ 19 cm × 直径 1 cm) と気泡トラップ (高さ 9 cm × 直径 1 cm) 部分は、MR 互換材料のみを使用して再設計されました。 さらに、これらのコンポーネントの寸法が縮小され、分光計の穴（直径 3.5 cm）の狭いチャネル内に直接収まるようになりました。 カーボゲンを泡立てた aCSF リザーバーとイメージング分光計の間では依然として大幅な脱ガスが発生しますが、ボア内人工肺装置により、ガス交換の終点と組織サンプルの間の灌流ラインの長さが大幅に短縮され (2.5 cm)、生理学的に適切な溶存酸素が維持され、 pH値。

組織ウェル（n = 6）の aCSF で測定された溶存酸素量を、ボア内人工肺装置によって供給される可変酸素量のガスの関数として示します（図 4）。 大気ガス (20 ～ 22% O2) と、さまざまな濃度の酸素 (95%、60%、19% O2) バランス窒素とカーボゲン (5% CO2) の 3 つの混合物をボア内人工肺でテストしました。 6 つの試験結果の平均溶存酸素測定値は、周囲空気 (20 ～ 22%) についてはそれぞれ 23.0%、96.2%、59.1%、および 19.2%、O2 ガスについては 95%、60%、および 19% でした。 結果は、95% O2、5% CO2 カルボゲンガスの直接バブリング中に灌流液リザーバーで実施された陽性対照試験 (n = 6) と比較されます: 95.1% O2 測定。 反復測定により、インボア型人工肺を使用した場合、100% のガス飽和効果が示されます (つまり、組織の飽和率は供給ガスの O2 含有率とよく一致します)。 逆に、外部人工肺を使用した場合、組織灌流部位の溶存ガス含有量は、供給ガスの酸素含有量パーセントと同等ではありませんでした (表 1)。 反復試験 (n = 10) では、95% O2 濃度の供給ガスを使用した場合、組織灌流部位における aCSF の平均溶存酸素含有量は 43.43% O2​​ でした。 これは、外部膜型人工肺を使用して測定した場合、灌流液リザーバー (95.54% O2 陽性対照) と灌流チャンバー (43.43% O2​​) の間で発生する総溶存 O2 の 54.3% の損失を表します。

可変酸素含有量のガスを使用したインボア型人工肺を使用した組織灌流部位における aCSF の溶存酸素ガス (O2) 特性。

カルボゲンガスの 3 つの混合物 (5% CO2 + 95%、60%、19% O2 バランス N2) を、大気ガス (20 ～ 22% O2、23% 測定) および陽性対照 (95% を直接バブリングした) に曝露した aCSF リザーバーと比較します。 % O2、5% CO2 カーボゲン)。 3 つの例すべてにおいて、aCSF 内の測定された溶存酸素含有量は、供給されたガス混合物内に含まれる濃度の 100% 飽和に近づきます。 データは、計算された標準偏差に等しい正の誤差バーを持つグループ平均 (n = 6) として表示されます。

組織灌流部位の pH を測定した複数の試験 (n = 8、供給ガス = 95% O2、5% CO2) の結果を示します (表 1)。 ボア内人工肺装置を使用した aCSF の平均 pH 測定値 (7.32) を、外部人工肺を使用して取得した値 (8.13) と比較しました。 インボア人工肺を使用したときに取得された測定値のみが、生理学的に適切な神経組織代謝を維持する能力のために選択された目標 pH 範囲内にありました (7.3 ～ 7.4)。 直接泡立てたaCSFリザーバーからのpH測定結果（ポジティブコントロール、7.36）は生理学的範囲内に収まりましたが、未処理（すなわち脱気した）aCSFリザーバーから得られたpH測定結果（ネガティブコントロール、8.22）は、体外式人工肺を使用したときに見られる測定値により類似していました。 。

実験時間 (合計 21 時間) の関数としての拡散強調 MR 信号 (任意の単位)​​ が、連続 (2 ml/分) 灌流を伴う試験と灌流を伴わない静的試験 (対照) の 2 つの実験条件で報告されます (図 5)。 ）。 複数の実験 (n = 3) からの平均シグナルが計算され、12 の別々の 1.5 時間の時点でグラフ化されます。 同等性の統計的テストにより、テストされたすべての時点で同等性の基準が満たされていることが確認されました。 4.5時間および6.0時間の時点で提示されたデータ（n = 2）には、3番目のシリーズの収集中に発生したハードウェアの故障により、残りのグループよりも1つ少ない測定値が含まれていたため（図S1およびS2）、統計的テストから除外されました。 。

一定の灌流条件下および灌流なしの条件下での固定マウス皮質スライス (300 μm) での MR 信号安定性テスト。

連続 (: 2 ml/分) および静的 (: 灌流液流量なし) 制御によるイメージング シリーズにおける経時的 (合計 21 時間) の拡散強調シグナル (任意の単位)​​。 12 回の個別のイメージング実験にわたる平均信号 (n = 3) が報告されます。 4.5 時間および 6.5 時間の時点での 3 つの測定値のうち 1 つは、収集に影響を及ぼしたハードウェアの故障のため、3 番目のシリーズから除外されました。 統計的テストにより、グループ間の同等性の条件 (範囲 = 静的コントロール グループ [±9%] によって示された経時的シグナル分散 [21 時間]) が、テストした 12 時点すべてで満たされたことが示されています。 データは、標準偏差に等しい正および負のエラーバーを持つグループ平均として表示されます。 わかりやすくするために、静的対照グループからはエラーバーを省略しました。

拡散強調 MR 信号強度を通じて示される組織の安定性は、実験時間 (15.5 ～ 21.5 時間) の関数として、すべてのライブ スライス データ セットについて分析されました (図 6)。 各時点で報告されるシグナルは、大きな関心領域 (ROI) にわたる平均シグナル強度です。 各サンプルでは、​​すべての時点で同じ ROI が使用されました。 灌流戦略間の信号の安定性を比較できるようにするために、各データ系列を最初の測定 (3 時間) の強度に正規化します。 このデータ表示では、灌流が不十分な組織は、虚血によって引き起こされる拡散率の低下の結果として、時間の経過とともに信号強度の増加を示します。 また、完全に安定したサンプルの参照時系列として、固定組織からのシグナル曲線 (初期時点での強度に正規化された) も含めます。 4 つの独立した灌流プロトコルを利用した実験を、固定組織 (安定したコントロール) および灌流されていない生きた組織 (不十分な代謝産物コントロール) と比較します。 予想通り、非灌流皮質（図6a）は、拡散信号挙動の突然かつ持続的な増加を示します。 逆に、固定サンプルから得られた拡散測定値は、18.5 時間の時間経過を通じて比較的一定のままです ()。 灌流された生きた皮質スライス（図6a）は、さまざまな程度の拡散信号変化を示し、最も顕著なのは14時間の時点後の連続灌流された皮質サンプル（）で見られます。 図 6a では、残りの灌流レジームは、断続的灌流 ()、長い灌流間隔とそれに続く短いスキャン ()、および長い灌流間隔とそれに続く長いスキャン () です。 間隔の長さについては、ライブ スライス灌流に関するメソッドのセクションを参照してください。

微量灌流およびボア内人工肺装置を使用したラットの生きた急性皮質スライスの特性評価。

実験時間 (15.5 ～ 21.5 時間) の関数として初期測定 (3 時間) に正規化された拡散強調 MR 信号 (任意の単位)​​ が報告されます。 (a) 4 つの独立した灌流プロトコルを利用した実験を、固定組織 (安定したコントロール) および灌流されていない生きた組織 (代謝不全) と比較します。 非灌流皮質は、拡散シグナルの急激かつ持続的な増加を示しますが (3 ～ 15.5 時間)、固定サンプルは全体を通して比較的一定のままです (3 ～ 18.5 時間)。 灌流を受けている急性皮質スライスは、時間の経過とともに、2 つの対照条件下で観察されたものの中間である適度な信号変化を示します。 灌流トライアルキー (連続 = 21.5 時間のタイムコース全体で灌流をオンにして 1.5 時間のスキャン、データ収集中は灌流をオフにして灌流をオフにして 1.5 時間のスキャン、その間に 10 分間の灌流間隔でオン)、長期間隔/ロングスキャン = 灌流を使用して 1.5 時間のスキャンデータ収集中はオン、スキャン間の 10 分間はオフ、長い間隔/短いスキャン = 灌流をオフにして 4 分間のスキャンを実行し、灌流をオンにして 1.5 時間の間隔を挟む）。 (b) 共有時間経過 (3 ～ 15.5 時間) にわたる灌流試験からのデータをグループ化すると、これらのスライスは固定組織コントロールと同様の拡散信号安定性挙動を示します。 初期測定 (3 時間) に対して正規化された拡散強調 MR 信号 (任意の単位)​​ が時間の関数として報告されます。 データはグループ平均値 (n = 4) として報告され、正および負の誤差バーは平均値の標準誤差に等しくなります。

図 6b は、これらすべての灌流戦略をグループ化し、非灌流急性スライスと固定サンプルの信号時間経過と比較したものを示しています。 このグラフは、すべての測定条件を含む時間経過に限定されています（3.0 時間から 15.5 時間、図 5b）。 灌流された皮質スライスは、固定組織コントロールと同様の安定した拡散信号特性を示します。

本研究では、超高磁場環境で行われる外植片研究で使用するために、新しく設計および製造された微小灌流システムと人工肺装置について説明します。 これらのコンポーネントは、細胞研究に使用される高磁場 MR イメージング装置によって課せられる厳しい空間的および材料的制限に適合するように特別に設計されており、既存の商用微量灌流装置では利用できない特別な機能を備えています。 重要なのは、リグの材料はすべて MR 実験の電磁環境 (静磁場および時間変動磁場) と互換性があるため、安全に取り扱うことができ、(主磁場の均一性の低下などによる) 測定品質を妨げないことです。 さらに、当社のボア内人工肺装置は、事前混合カーボゲン供給ガス中の複数の濃度の酸素を使用してテストしたところ、100% の溶存酸素 (O2) 飽和特性を示しました (図 4)。 これらの結果は、ボア内人工肺と微量灌流リグを使用した場合、aCSF の酸素ガス飽和における O2 損失が事実上 0% であることを示しています。 さらに、組織灌流部位における O2 飽和は、供給ガスの混合物中の O2 濃度を調整することによって正確に制御できることを示しています。 この機能により、研究者は組織固有の、さらには活動に依存した代謝要件の違いに基づいて実験条件を調整できるため、オペレーターの制御が強化されます29、30、31、32。 組織灌流の位置 (この場合はイメージング分光計のボア内) でのこのような精度と制御は、体外サンプル調製物を使用して適切に構成された再現可能な科学的研究を作成するために不可欠です。 aCSF の溶存 O2 含有量の半分以上 (54.3%) が、外部膜型人工肺から組織ウェル (5 m) までの移動中に失われたという我々の発見は、追加の MR 固有のハードウェア開発の必要性を強調しています。 このような結果が、高保持性、低ガス透過性の灌流ライン (Cole-Parmer、06508-13) を使用した場合でも得られたということは、既存の灌流装置を改造した単純なエンジニアリング ソリューションでは、生体外 MR 顕微鏡で適切な実験条件を達成するには不十分であることを示唆しています。勉強します。

今回の研究には、酸素を使用して行われたような溶存 CO2 ガスの直接定量は含まれていませんでしたが、重炭酸塩緩衝 aCSF の pH 測定値は、ガスの影響の高感度な測定として機能しました。 これは、供給された CO2 が、重炭酸緩衝システムの一部として炭酸中間体を介して炭酸イオンおよび重炭酸イオン、つまり遊離プロトンを形成する際に果たす役割によるものです。

記載されている化学成分は、呼吸および排泄の代謝プロセスを介して哺乳動物の生理学的 pH を調節する目的で自然に利用されているものと同じです 33,34。 炭酸水素緩衝液を含む灌流液または培地に CO2 を供給すると、CO2 は哺乳類の神経組織の生理学的に許容される範囲である 7.3 ～ 7.435、36 に pH を安定させるように作用します。 これが、重炭酸緩衝組織培養システムに供給される炭酸ガス混合物 (95% O2、5% CO2) に CO2 が広く使用されている理由です。 このような系に CO2 を添加すると、炭酸が増加し、したがってこの化合物が解離する重炭酸イオンと水素イオンが増加し、最終的に pH が低下します。 逆に、培地内の条件が酸性になりすぎると、過剰な水素イオンが重炭酸塩によって捕捉され、CO2 の放出時に水分子の中に取り込まれ、その結果 pH が上昇します。 したがって、重炭酸緩衝媒体中で生理学的に適切な pH 条件を維持するには、CO2 ガスの一定の供給が必要です。 現在の研究で使用されたカーボゲン混合物中に存在する CO2 濃度 (5%) は、これらの条件を維持するのに十分であることが知られている工業標準です。 しかし、これを外部膜型人工肺と組み合わせて供給ガスとして使用した場合、組織灌流部位で測定された pH は 8.13 で、目標の pH 範囲である 7.3 ～ 7.4 と比較して過度にアルカリ性でした。 これらのデータは、リグに灌流液を供給するために使用される aCSF リザーバー内で目標 pH 条件が維持されているにもかかわらず観察されました (表 1)。 外部人工肺を使用して得られたpH測定と、上記の重炭酸塩緩衝化学の知識を組み合わせたところ、重炭酸イオンの供給が不十分であり、したがって遊離プロトンが組織灌流部位のaCSFに維持されていないことが示唆されました。 この問題は組織ウェルの上流の aCSF には存在しなかったため、灌流液が灌流リグの長さ、具体的には外部膜型人工肺を接続する 5 m の灌流ラインを通過するときに、意図しない pH の変化が発生したと結論付けることができました。私たちの組織灌流チャンバーへ。 したがって、観察されたシフトの最も可能性の高い原因は、イメージング分光計の中心に到達するために必要な灌流ラインの長距離にわたって発生する pCO2 の減少であると判明しました。 上記の体外式人工肺を使用した O2 テストの結果 (表 1) により、拡散プロセスによって膨大な量の溶存ガスが灌流ラインから漏れていることが確認されました。

さまざまな緩衝液が利用可能ですが、特に生物学研究の大部分で使用されるグッド緩衝液 37 は、非重炭酸緩衝灌流液系が海馬ニューロンの静止膜電位を変化させることが示されています 38。 したがって、生理学的に適切な pH 条件は、重炭酸ナトリウムを代替の緩衝剤に置き換えることによってより簡単に得られた可能性がありますが、将来の機能研究への目を含む特定の考慮事項により、そのような解決策を採用することはできませんでした。 さらに、外部人工肺を使用する場合、バッファーを変更することで生理学的に適切な pH を達成できたかもしれませんが、溶存酸素ガスの損失に関する問題は残っていたでしょう。

インボア膜型人工肺を微量灌流装置に組み込むと、組織ウェル内の pH 測定値が目標 pH 範囲内に制御されました (表 1)。 人工肺装置の交換後、灌流液ガスの最終部位と組織サンプルの間の距離は 250 分の 1 (5 m 対 2 cm) 減少しました (図 3)。 ガス交換部位と組織灌流部位の間の灌流ラインの長さのこのような短縮により、これらの拡散損失が発生する可能性のある全体の表面積と時間の両方が減少するため、溶存 CO2 の損失が防止されました。

これまでの ex vivo MR 顕微鏡研究の大部分は、移動する灌流液から生じるフローアーチファクトを排除するために、イメージングプロトコルの一部として不連続灌流を採用してきました 39,40,41,42,43,44,45,46。 これらの研究における対照実験では、断続的灌流法を使用した MR 信号の安定性が報告されていますが、代謝研究では、組織外植片が灌流液の連続代謝回転から生理学的に恩恵を受けることが示されています 47,48。 重要な栄養素を供給し、代謝の有毒な副産物を除去するという灌流液の役割を考えると、このような結果は驚くべきことではありません。 現在の研究では、マイクロ表面コイルの浅い浸透深さと、組織隔壁（300μm、図1）による灌流液からの空間的分離により、フローアーティファクトを生成することなく画像取得中に灌流を維持できるという仮説を立てました。 。 これをテストするために、我々は、連続灌流と静止した静止灌流の両方の条件下で、固定マウス皮質の拡散獲得を経時的（21時間）比較しました（図5）。 私たちの研究グループ内で実施された、灌流された急性海馬スライスの同様の拡散強調スキャンでは、1.5 時間ごとに 2 ml/分の速度で 5 分間の灌流を提供する間欠灌流プロトコルを使用して、8 時間の時間間隔にわたって信号の安定性が実証されました。スキャン時間49。 著者らは、安定した灌流組織グループの 8 時間間隔にわたる生の拡散シグナルの変動が約 8% であると報告しました。 この値は、静的コントロール グループに関する現在の研究で報告された 9% の生の拡散信号変動に非常に近いです (図 5)。 2 つの研究間の違い、特に固定スライスではなく鋭角スライスの使用を考慮すると、観察された驚くほど類似した拡散信号変動は、組織サンプル内で発生する変化というよりも、使用されるイメージング ハードウェアに固有の安定性の制限の結果である可能性が高くなります。

急性皮質スライスで実施した生きた組織実験の場合、拡散信号の安定性は、死亡時（TOD）およびその後のイメージング前のサンプル調製後15.5時間維持されました（図6）。 スライスの厚さ (300 μm) と実行温度 23℃ は、サンプル全体で十分な酸素分圧を達成するために選択され、一方、灌流液条件 (95% 溶存 O2、流速 2 ml/min) により効率的な代謝産物の送達と老廃物の除去が保証されました 50,51。 逆に、灌流されていない生きたスライスで観察された拡散シグナル強度の初期の増加は、スライスの細胞の原形質膜内のイオンポンプのATP枯渇に関連した機能不全によってもたらされた細胞浮腫と同時に発生した52,53。 低酸素による組織の膨張は、拡散強調 MRI 信号の増加として現れる、スライス内の拡散率の低下の原因となる物理的メカニズムです。 インボア人工肺を使用して灌流されたサンプルは、時間の経過に伴う拡散シグナルの変化が固定組織標本で観察されたものと同様であったため、代謝産物が損なわれたコントロールよりもはるかに優れた拡散シグナル安定性を示しました。 予想されたとおり、4 つの灌流サンプルからの平均データでは、グループ間の変動が時間の関数として増加しました。これは、時間の経過とともに測定された誤差の振幅の増加によって認識できます (図 6b)。 しかし興味深いことに、この組織が最も好ましい代謝条件にさらされているという仮定にもかかわらず、連続的に灌流されたサンプルは、4つの灌流されたスライスの中ではるかに大きな時間の経過に伴う拡散信号の変化を示しました（図6a）。 これらの変化は 14 時間の時点後に発生したことに注意してください。これは、電気生理学的記録に急性スライスが実行可能な 6 ～ 12 時間の時間経過よりも遅く、その後、同様の条件下で損傷した好銀性ニューロンが観察される 4 時間の限界よりもはるかに後でした。生理学的維持54。 スライスの健康に対するこのような影響は、細菌の細胞壁に存在するリポ多糖類およびリポペプチドへの曝露と関連付けられています55。 これらの細菌は灌流培地中に存在し、培養 6 時間から 12 時間の間に始まる集団密度の対数増加を経験します。 幸いなことに、aCSF灌流液中の細菌の増殖速度を延長し、その後急性スライス標本が機能的に生存し続ける期間を延長する工学的ソリューションがすでに開発されています。 ウェスタンシドニー大学の研究者らは、温度抑制と紫外線（UV）光の濾過を利用して、急性切片の電気生理学的特徴を56時間24～36時間保存できる特殊な灌流システムを製作した。 このような技術の実証済みの成功は、通常完了までに数時間かかる MR 顕微鏡画像の収集に計り知れない意味を持ちます。 現在のセットアップでボア内人工肺の上流に UV フィルター デバイスを組み込むと (おそらくバブル トラップ機構に統合されます)、組織外植片の研究における生存期間が 2 倍または 3 倍になる可能性があります。

ここで説明しテストした現在のリグ設計が、生体組織外植片の細胞分解能 MR 研究に採用され、将来の MR 互換灌流装置の開発に役立つことを願っています。

この記事を引用する方法: Flint、JJ et al. 生体組織外植片の磁気共鳴顕微鏡研究用に設計された微小灌流およびボア内酸素生成システム。 科学。 議員 5、18095; 土井: 10.1038/srep18095 (2015)。

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フロリダ大学神経科学学部、ゲインズビル、フロリダ州、アメリカ合衆国

ジェレミー・J・フリント & スティーブン・J・ブラックバンド

フロリダ大学マックナイト脳研究所、ゲインズビル、フロリダ州、アメリカ合衆国

ジェレミー・J・フリント、カンナン・メノン、スティーブン・J・ブラックバンド

フロリダ大学生物医工学部、ゲインズビル、フロリダ州、アメリカ合衆国

メノンさんを応援します

機能統合神経科学センター、オーフス大学、オーフス、デンマーク

ブライアン・ハンセン

フロリダ大学放射線学部、ゲインズビル、フロリダ州、アメリカ合衆国

ジョン・フォーダー

国立高磁場研究所、フロリダ州立大学、タラハシー、フロリダ州、アメリカ合衆国

スティーブン・J・ブラックバンド

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JJF、BH、および JF がプロトタイプの微小潅流リグを設計しました JJF と BH がプロトタイプの微小潅流リグを製作しました JJF がプロトタイプのボア内人工肺を設計しました JJF と KM がプロトタイプのインボア人工肺を製作しました JJF と KM がデータ収集を実行しました BH と JJF がデータ分析を実行しましたJJF、BH、JF、KM、SB が原稿を執筆、編集しました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

この作品は、クリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材がクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

フリント、J.、メノン、K.、ハンセン、B​​. 他。 生体組織外植片の磁気共鳴顕微鏡研究用に設計された微小灌流およびボア内酸素生成システム。 Sci Rep 5、18095 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep18095

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受信日: 2015 年 8 月 12 日

受理日: 2015 年 11 月 6 日

公開日: 2015 年 12 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18095

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