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Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 164 (2023) この記事を引用

3124 アクセス

1 引用

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

三次元網膜オルガノイド (3D-網膜) は、移植治療の有望な移植片ソースです。我々は以前、ヒト多能性幹細胞（hPSC）から3D網膜を生成するための自己組織化培養物を開発しました。ここでは、組織シート移植の品質管理方法と前臨床研究を紹介します。自己組織化 hPSC は網膜組織とオフターゲット組織の両方に分化しました。遺伝子発現解析により、主なオフターゲット組織が眼関連組織、皮質様組織、および脊髄様組織であることが特定されました。品質管理のために、各 hPSC 由来神経上皮を 2 つの組織シートに解剖する qPCR ベースの検査を開発しました。網膜組織の選択を確実にするため、移植用の内中心シートと qPCR 用の外周シートです。 qPCR の間、組織シートは新しく開発された保存方法を使用して 3 ～ 4 日間保存されました。ラットの腫瘍原性研究では、移植に関連した有害事象は観察されませんでした。網膜変性モデルラットでは、移植された網膜は成熟した光受容体に分化し、電気生理学アッセイで光反応を示しました。これらの結果は、自己組織化網膜シート移植療法に対する我々の理論的根拠を示しています。

多能性幹細胞 (PSC) は、三次元 (3D) 神経組織を自己組織化する能力を持っています1。 3D 組織を伴う自己組織化凝集体はオルガノイドと呼ばれ、細胞/組織移植療法の有望な移植源となります。ヒト網膜移植治療に向けて、いくつかの網膜分化法が開発されています2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22。中でも、自己組織化幹細胞培養技術 SFEBq (素早い凝集を伴う胚様体様凝集体の無血清浮遊培養) は、3D 網膜の生成に有用です 5,6,7,8,15,17。我々は以前、フィーダーフリーのヒト胚性幹細胞（ESC）および人工多能性幹細胞（iPSC）から3D網膜を生成するために、時限骨形成タンパク質（BMP）処理によってSFEBq法を修正しました7、8。この培養系の 3D 網膜には、拡大して光受容体やその他の網膜ニューロンを生じ、段階に応じて多層の重層網膜組織を形成する神経網膜 (網膜) 前駆細胞が含まれており、生体内での発生を再現します。

網膜色素変性症は、桿体光受容体とそれに続く錐体光受容体の進行性喪失を特徴とする一群の遺伝性疾患であり、先進国における失明の主な原因となっています。光受容体および/または網膜前駆細胞の移植は、有望な治療選択肢です 23、24、25、26。実際、初代胚組織からの網膜組織および細胞の移植には、視覚機能を改善する可能性がある23,27,28,29が、組織/細胞生着およびドナー-宿主物質移行の寄与についてはまだ研究されていない30。細胞治療に十分な量の網膜組織と細胞を供給するために、PSC から生成される 3D 網膜は有望な移植源となります。 PSC 由来の網膜から精製された光受容体前駆体は生き残り、宿主の網膜と接触し、視覚機能を改善します 10、17、18、26、31、32。 3D 網膜から解剖されたマウスおよびヒトの網膜組織シート (以下、網膜シート) は、末期網膜変性モデルのマウスおよびラットに生着され、光反応の回復をもたらす機能的成熟を示しました 33,34,35,36,37。さらに、hPSC 由来の 3D 網膜は、低い免疫原性と免疫抑制特性を持っていました 38。網膜変性の霊長類モデルにヒト PSC 網膜シートを移植すると、2 年間の長期生着が示されました 36,39。これらの前臨床移植研究は、同種異系 PSC 由来の網膜シートが視覚機能を改善する可能性があることを示しています。

PSC由来網膜シートの臨床応用に向けて、3D網膜（中間製品）と解剖網膜シート（最終製品）の品質管理（QC）戦略の確立が依然として大きな課題となっている。自己組織化培養が改良され、バッチ内およびバッチ間の両方のレベルでオルガノイドの変動が減少しました。 Eriraku らは、PSC 由来の凝集体のサイズと品質を制御する SFEBq 法を開発しました 5,40。我々は、オルガノイドの形態や神経網膜（網膜）と網膜色素上皮（RPE）の比率など、オルガノイドの品質の多様性を減らすために改変された培養システムを開発しました7,8。ただし、個々のオルガノイドは依然として多様な3D形態と複数の異なる形態を示します。標的組織。一部のオフターゲット組織は、RPE 組織および皮質様組織として同定されました 7,12。我々の以前の移植研究では、移植に適した網膜細胞を標識するために、Rx（Raxとも呼ばれる）およびCrxの蛍光タンパク質ノックインレポーターラインを保有するPSCラインを使用しました6、35、39。しかし、異種蛍光タンパク質ノックインレポーター株は臨床応用には理想的ではありません。ここでは、オルガノイド内の網膜組織を選択するための新しい QC 戦略を確立します。次に、同種網膜シート移植療法の理論的根拠を実証するために、前臨床の安全性と有効性の研究を実施しました。

網膜組織移植治療に向けて、我々はこれまでの研究5,6,7,8,33,39に基づいて、5つのプロセスからなる堅牢な網膜分化法を開発した。 (1)フィーダーフリーhPSC培養による維持培養とプレコンディショニング法、 2）SFEBqおよびBMP法による網膜分化、（3）誘導反転培養、（4）成熟培養、および（5）解剖（図1a）。

自己組織化文化のスキーム。 b 14、42、91、および180日目の網膜組織を含むiPSC-S17由来細胞凝集体の明視野像（上）。明視野でのスケールバー: 100 μm。 14、42、91、180日目のiPSC-S17由来網膜組織の免疫染色（中下）。中央パネルの Crx (緑) と Chx10 (赤)。下のパネルの Pax6 (緑) と Recoverin (赤)。青: DAPI による核染色。免疫染色のスケールバー: 20 μm。 c 180日目のiPSC-S17由来網膜組織の免疫染色。左上のパネルのRXRG（緑）およびNRL（赤）。右上パネルの Lhx2 (赤)。左下のパネルのCtBP2（緑）とRecoverin（赤）。右下のパネルのコーンアレスチン (緑色)。青: DAPI による核染色。スケールバー: 20 μm。 d 0、6、14、45、60、および80日目の網膜組織を含むiPSC-S17由来細胞凝集体における遺伝子発現分析。各複製では、48個の凝集体からRNAが抽出されました。 mRNAレベルはqPCR分析によって決定されました。相対的な mRNA 発現は、内因性対照として GAPDH を使用したデルタデルタ Ct 法によって決定されました。データは平均値 ± SE (時点ごとに n = 4) として表示されます。 e iPSC-S17由来の網膜シートの明視野像。スケールバー: 100 μm。 f 87日目のiPSC-S17由来網膜シートの免疫染色。左パネルのCrx（緑）およびChx10（赤）。右パネルの Rx (緑) と Recoverin (赤)。青: DAPI による核染色。スケールバー: 100 μm。

プロセス 1 では、ヒト iPSC 細胞株を StemFit 培地の LM511-E8 マトリックス上で維持しました 41,42。 4 つの iPSC 細胞株、iPSC-S17、iPSC-LPF11、iPSC-1231A3、および iPSC-QHJI01s04 (iPSC-Q) は、このフィーダーフリー維持培養で安定して増殖し、倍加時間は約 12 ～ 18 時間でした。 iPSC は、分化前に 18 ～ 30 時間、SB431542 (SB; TGF-β/Nodal/Activin シグナル伝達の阻害剤) とスムージングアゴニスト (SAG; Shh シグナル伝達アゴニスト) でプレコンディショニングされました (以下、SB + SAG)8。工程２では、SFEBq-BMP法を用いて3D網膜分化培養を行った。 iPSC を単一細胞に解離し、V 底 96 ウェルプレートに播種し、Y-27632 および SAG8 の存在下で分化培地 (増殖因子を含まない CDM [gfCDM] + ノックアウト血清置換 [KSR]) で培養しました。得られた iPSC 凝集体を 3 日目に BMP4 で処理し、gfCDM+KSR 培地で培養しました7。 14 日目に、iPSC 凝集体を固定し、網膜前駆細胞マーカー Pax6 および Chx10 (Vsx2 とも呼ばれます) について免疫染色しました。 iPSC凝集体の表面には神経上皮が含まれていることが判明し、神経上皮内の細胞の大部分はChx10およびPax6陽性であり、iPSCが自己形成した未熟な網膜組織であることが示されました（図1b）。プロセス 3 では、神経網膜 (網膜) と RPE7 の比率を正確に制御するために、未熟な網膜組織を誘導反転培養法を使用して培養しました。未成熟網膜組織を CHIR99021 (CHIR; Wnt アゴニスト) および SU5402 (SU; FGFR 阻害剤) とともに 3 日間培養して細胞を RPE 運命に偏らせ、その後血清およびタウリンを含む網膜成熟培地中でさらに 23 日間培養して、誘導反転中間体。プロセス 4 では、誘導反転中間体を血清、タウリン、T3 を含む網膜成熟培地でさらに 20 ～ 60 日間培養し、3D 網膜を取得しました。 60 ～ 100 日目に 3D 網膜を固定し、Chx10、Pax6、Crx (光受容体前駆体マーカー)、および Recoverin (光受容体マーカー) について免疫染色しました。 3D網膜には、外表面にCrx+およびRecoverin+細胞を含む光受容体前駆体層、中央にChx10+/Pax6+細胞を含む網膜前駆層、およびChx10-/Pax6++を含む神経層からなる多層網膜組織が含まれていることが判明した。細胞と内側のCrx +およびRecoverin +細胞（図1bおよび補足図1a、b、c）。

さらに、オールトランスレチノイン酸を含む長期成熟培地で3D網膜を培養し、網膜成熟マーカーの発現を調べました。 180日目の3D網膜には、光受容体層と網膜前駆層を含む多層網膜組織が含まれていることが確認されました（図1b、c）。 NRL+、RXRG+、および錐体アレスチン+細胞は、3D網膜の外側光受容体層で見つかり、桿体前駆体と錐体前駆体への分化を示しています（図1c）。 Lhx2+ 神経層は 3D 網膜の内側に見つかりました (図 1c)。一部のRecoverin +細胞はCtBP2（Ribeyeとも呼ばれます）を発現しており、iPSC由来の光受容体が光受容体シナプスタンパク質を発現する能力を持っていることを示唆しています（図1cおよび補足図1d）。

遺伝子発現を分析するために、0、6、14、45、60、および80日目にiPSC凝集体のqPCR分析を実行しました（図1dおよび補足図1e）。網膜前駆体マーカー（Rx、Chx10）、光受容体マーカー（Crx、Recoverin）、錐体光受容体前駆体マーカー（RXRG）のmRNAレベルは、それぞれ6〜14日目、45日目、60日目に増加した。 PSC マーカー Oct3/4 の mRNA レベルは 6 日目に減少しました。これらのデータは、以前の 3D 網膜分化培養研究 5、6、7、8 と一致しています。

プロセス 5 では、60 ～ 100 日目の 3D 網膜を解剖して網膜シート (最終製品) を作成しました (図 1e)33,39。免疫組織化学（IHC）分析により網膜シートの形態を確認し、外表面にCrx+細胞とRecoverin+細胞を含む視細胞前駆体層、内側にChx10+細胞とRx+細胞を含む網膜前駆細胞層を持つ多層連続網膜組織を観察しました。 (図1f)。これら 5 つのプロセスを使用して、ヒト同種異系 iPSC 由来網膜シートが再現性よく生成されました。

自己組織化培養物は胚発生を模倣し、網膜組織とオフターゲット組織の両方を誘導しました。我々は、凝集体の形態に基づいて、この培養物中の主要なオフターゲット組織を特定しようとしました。自己組織化培養によって網膜運命に向かって分化した iPSC-LPF11 細胞を明視野顕微鏡分析に供しました。 iPSC-LPF11細胞は、網膜組織と、網膜組織とは異なる形態を有する3つのオフターゲット組織（オフターゲット組織-1、-2、および-3）に自己組織化することがわかりました（図2a）。網膜組織の典型的な形態は、明るい外層と茶色の内層を備えた多層連続神経上皮構造でした（図1bおよび2a）。オフターゲット組織の典型的な形態は、色素沈着および/または色素沈着のない薄いしわのある上皮 (オフターゲット組織-1)、粗い外表面を持つ粘着性の細胞凝集体 (オフターゲット組織-2)、および暗色の組織でした。内部が詰まった着色された凝集体 (オフターゲット組織-3) (図 2a)。 2つの細胞株、iPSC-LPF11およびiPSC-S17からの3つの独立した培養バッチを区別し、網膜組織とオフターゲット組織を含む凝集体の割合を調べました（図2b、各バッチあたりn = 59〜95の凝集体）。すべてのバッチで、ほとんどの凝集体には網膜組織が含まれており、オフターゲット組織-1 を含む凝集体の割合は、オフターゲット組織-2 またはオフターゲット組織-3 を含む凝集体の割合よりも高い傾向がありました。

iPSC-LPF11由来の細胞凝集体における網膜組織とオフターゲット組織の明視野像。スケールバー: 100 μm。 b 網膜組織およびオフターゲット組織を含む細胞凝集体の割合。 iPSC-LPF11 細胞由来の 3 つの独立したバッチと、iPSC-S17 細胞由来の 3 つの独立したバッチを分析しました (各バッチあたり n = 59 ～ 95 の凝集体)。データは平均値±標準誤差として表示されます。 c iPSC-LPF11細胞由来の網膜組織およびオフターゲット組織における遺伝子発現のヒートマップ。対照として、未分化iPSC-LPF11細胞における遺伝子発現も示します。遺伝子発現は qPCR 分析によって測定されました。各組織の行 Z スコアが計算され、ヒートマップとしてプロットされました。 d iPSC-LPF11細胞に由来するオフターゲット組織-1および-2の代表的な明視野画像およびIHC画像。明視野画像と IHC 画像は同じ位置で撮影されました。 Aqp1 (右上; 赤) および Emx2 (右下; 赤) の免疫染色を示します。青: DAPI による核染色。スケールバー: 100 μm。 e iPSC-1231A3細胞由来の網膜組織およびオフターゲット組織-3における遺伝子発現のヒートマップ。 mRNAレベルはマイクロアレイ解析により測定した。各遺伝子の LogFC 値を計算し、ヒートマップとしてプロットしました。 FC、フォールドチェンジ。網膜組織と比較して、オフターゲット組織 3 は Hox 遺伝子を発現していることに注意してください。

細胞系統を同定するために、iPSC 由来のオフターゲット組織 1、オフターゲット組織 2、およびオフターゲット組織 3 を、おそらく少量の周囲組織とともに手動で解剖し、関連する主要な遺伝子の mRNA レベルを調べました。運命選択、分化、および/またはパターン化を伴う運命は、qPCR分析によって決定されました。各遺伝子のCt値に基づいて、各組織のZスコアを計算し、ヒートマップとしてプロットして、組織内の遺伝子発現パターンを分析しました（図2c）。我々は、オフターゲット組織-1がAqp1とMitfを発現していることを発見し、それがRPEと毛様体を有する眼関連組織であることを示した43,44。オフターゲット組織 2 は Emx2 を発現しており、これはそれが胚皮質様組織であることを示しています 45。オフターゲット組織-3 は、ホメオボックス遺伝子 HoxB246,47 の高い発現を示しました。未分化 hPSC マーカー Lin28a は、3 つのオフターゲット組織または網膜組織では検出されませんでした 48。

IHC分析を実行し、オフターゲット組織-1がRPEおよび毛様体マーカーAqp1について陽性であるのに対し、オフターゲット組織-2は胎児皮質（背側終脳）マーカーEmx2について陽性であることを確認しました（図2dおよび補足図2a）。）。マイクロアレイ解析によりオフターゲット組織-3の遺伝子発現を調べたところ、HoxB2を含む複数のHox遺伝子が発現していることがわかり、後部神経脊髄様組織であることが示されました（図2e）。さらに、オフターゲット組織の遺伝子発現パターンが網膜組織の遺伝子発現パターンとは異なることを確認しました（補足図2b）。

自己組織化培養法を使用して、hPSC は集合的に強力に分化して多層網膜組織を形成しました。主なオフターゲット組織は、Aqp1+ 眼関連組織 (オフターゲット組織-1)、Emx2+ 皮質様組織 (オフターゲット組織) でした。 -2)、および HoxB2+ 脊髄様組織 (オフターゲット組織-3)。

自己組織化された網膜組織は、独特の多層連続神経上皮構造を持っていました（図1、2）。したがって、解剖時に明視野顕微鏡で凝集体を注意深く観察することにより、網膜組織を特定することができます（プロセス5）。しかし、この培養物中の PSC は網膜組織だけでなくオフターゲット組織にも分化したため (図 2)、最終産物を生成するためにオフターゲット組織が切除される潜在的なリスクがあります。臨床応用に向けて、移植可能な網膜シートを確実に選択し、誤って対象外の組織が混入することを回避するためのフェイルセーフQC手法の開発を目指しました。すべての網膜シートに対する qPCR ベースの QC 検査は、ターゲット外の組織を検出する高感度な方法ですが、この検査の実行は移植可能なすべての網膜シートの破壊につながります。この破壊を避けるために、連続神経上皮を2枚の組織シートに切り分けることにしました。移植用の内中央シート（「キャップ」と名付けられました）とQCテスト用の外周シート（「リング」と名付けられました）です（図3a）。）。各内中心シート（キャップ）の遺伝子発現を推定するために、対応する各外周シート（リング）のqPCR分析を実行します（図3a、以下リングPCRテスト）。

a プロセス 5 (解剖) のキャップとリングの解剖およびリング PCR テストのスキーム。 b 代表的なキャップとリングの明視野画像（左）と IHC 画像（中央、右）。キャップとリングは iPSC-LPF11 細胞に由来します。 Crx (中央、緑色)、Chx10 (中央、赤色)、Pax6 (右、緑色)、および Recoverin (右、赤色) の免疫染色を示します。 DAPI は青色で表示されます。スケールバー: 100 μm。 c iPSC-LPF11細胞由来のキャップおよびリングにおける遺伝子発現のヒートマップ。対照として、未分化iPSC-LPF11細胞における遺伝子発現も示します。遺伝子発現は qPCR 分析によって測定されました。各キャップとリングの行 Z スコアが計算され、ヒートマップとしてプロットされました。 d 同じ集合体から切り出されたキャップとリングの代表的な遺伝子発現を回帰線付きのプロットとして示します（左）。各キャップとリングの間の遺伝子発現の決定係数 (R2) を示します (右)。 #1 ～ #6 は、(c) の組織 #1 ～ #6 に対応します。 e 網膜シート、オフターゲット組織-1、オフターゲット組織-2、および未分化iPSCから得られた単一細胞PCRデータのバイオリンプロット。光受容細胞 (Crx、Recoverin)、網膜前駆細胞 (Chx10、Rx、Pax6)、その他の網膜ニューロン (Pax6、AP2A、STMN2)、およびオフターゲット組織 (Aqp1、Emx2、HoxB2、Lin28a) の遺伝子の発現が示されています。。

iPSC由来の3D網膜で自己形成された連続神経上皮をキャップとリングに切り分けました（図3a、b）。キャップとリングは両方とも、外表面にCrx+細胞とRecoverin+細胞を含む光受容体前駆体層と、内側にChx10+細胞とPax6+細胞を含む網膜前駆細胞層を含む多層連続網膜組織を含んでいることが判明した。

キャップとリングの遺伝子発現パターンを比較しました。さまざまな神経上皮をキャップ組織とリング組織に解剖し、遺伝子発現をqPCRによって測定しました（図3c）。我々は、同じ神経上皮に由来する各キャップとリングの遺伝子発現パターンが類似していることを発見しました。類似性を統計的に解析するために、各キャップとリングの遺伝子発現について回帰直線を描き、決定係数（R2）を計算しました。キャップとリングのすべてのセットの R2 値がほぼ 1.0 であることがわかりました (図 3d および補足図 3a、b)。これらのデータは、網膜遺伝子およびオフターゲット組織マーカー遺伝子の遺伝子発現レベルが、同じ集合体から切り出したキャップとリングの間でほぼ同じであることを示しています。

次に、各リングの qPCR を実行します (図 3a、リング PCR テスト)。リングが網膜遺伝子を発現し、図3cの組織#1〜6などのオフターゲット組織マーカー遺伝子をあまり発現しない場合、対応するキャップを移植用の網膜シート（最終製品）として選択できます。 4つのiPSC株に由来し、リングPCRテストに合格した網膜シートは、確かに同様の網膜遺伝子発現パターンを示しました（補足図3c）。さらに単一細胞PCR（scPCR）分析を実行したところ、網膜シートの大部分の細胞がChx10、Crx、Recoverin、Rx、Pax6、AP2A、またはSTMN2を発現していることがわかりました（図3e）。

これらの結果は、リング-PCR検査がキャップ内の遺伝子発現を推定して網膜細胞からなる網膜シートを選択できることを実証した。

解剖工程から網膜シート移植までの間には、移植可能な網膜シートを選択するためにリングPCR検査を含むQC検査を実施する必要があります。ただし、リング PCR 検査を完了するには少なくとも 1 ～ 2 日かかります。以前に報告されているように 6,20 、網膜組織は凍結および解凍することができますが、ヌードラットへの凍結網膜組織の網膜下移植では生着障害が示されました。そこで私たちは網膜組織の非凍結保存法の開発を目指しました。

まず、iPSC 由来 3D 網膜および解剖した網膜シートの非凍結保存に最適な培地と温度を検討しました。最適な培地を決定するために、保存溶液の候補として網膜成熟培地、ウィスコンシン大学 (UW) 溶液、平衡塩類溶液 (BSS)、および Optisol-GS (以下、Optisol) を評価しました 49,50,51, at 4, 17,そして37℃。 iPSC由来の3D網膜を生成し、さまざまな条件下で3日間保存し、回復培養物として網膜成熟培地中で37℃で7日間培養しました（図4a、b）。保存網膜と対照網膜を固定し、免疫染色して網膜組織の形態を確認した。 BSSまたはOptisolを使用した17℃での保存が、多層連続網膜上皮構造を維持するのに最適な条件であることがわかりました（図4a）。 4 °C での保存は網膜に損傷を与える可能性があるため、好ましい条件ではありません。膵臓を含む末梢組織を保存するための黄金標準である UW 溶液も好ましくありませんでした。 UW 溶液と Optisol の違いの 1 つは、塩化カリウム (KCl) の濃度でした。UW 溶液では 120 mM、Optisol では 5.33 mM でした。実際、120 mMのKClを添加したOptisolは、網膜組織の形態を損なった(補足図4a)。一貫して、BSSおよびダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、哺乳動物細胞培養に使用される基礎培地）中のKClの濃度は5.3 mMであり、BSSおよびDMEMでは17℃での保存が好ましいことがわかりました（図4aおよび補足図）。 4b）。これらの結果は、KCl の濃度が保存液の重要な要素である可能性を高めます。これらの結果を踏まえ、ヒト角膜移植の臨床現場で広く使用されているオプティソルを非凍結保存液として選択しました51。

a 非凍結保存条件のスクリーニング。＋＋＋：多層連続網膜上皮が保存されていた。 ++: 多層連続網膜上皮は保存されているが、神経ロゼットが出現している。 +: 多層連続網膜上皮が観察されましたが、非常に限られていました。 –、保存後に多層連続網膜上皮は観察されなかった。 b 保存実験のスキーム。 c 多層網膜組織におけるCrx+光受容体前駆体の割合。比率は、Crx+ 細胞の数を核の数 (DAPI) で割ることによって計算されました。データは、n = 5 (4 °C)、4 (12 °C)、4 (15 °C)、5 (17 °C)、5 (20 °C)、5 (22 °C) の平均 ± SE として表示されます。 )、4 (37 °C)、および 3 (対照培養)。 d 保存されていない網膜（対照）および4日間保存された網膜における細胞生存率。データは平均値 ± SE (グループあたり n = 5) として示されています。 e 保存されていない網膜（対照）および4日間保存された網膜におけるChx10およびCrxの遺伝子発現。データは平均±標準誤差として表示されます（グループあたり n = 3）。 f 保存されなかった網膜（d70 + 0）、Optisol で 2 日間（d70 + 2）および 4 日間（d70 + 4）保存された網膜、および Optisol で 4 日間保存され、その後 3 日間回復培養された網膜の IHC 分析（ d70 + 4 + 3) および 7 日 (d70 + 4 + 7)。上部パネルの Ki67 (赤) 染色。下のパネルはEdU染色（緑色）。 DAPI は青色で表示されます。スケールバー: 50 μm。 g 各グループの幅 100 μm の多層網膜組織あたりの EdU 陽性細胞の数。データは平均±標準誤差として表示されます（グループあたり n = 6）。 ***p < 0.001 (一元配置分散分析とそれに続くテューキー検定)。 h 解剖、リング PCR 検査、網膜シートの発送のスキーム。 ns、重要ではありません。

最適な保存温度を決定するために、3D 網膜を Optisol 中で 4、12、15、17、20、22、および 37 °C で 3 日間保存し、その後、網膜成熟培地で 37 °C で 7 日間培養しました。回復培養（図4b）。 IHC 分析を実行したところ、Crx+ 細胞の割合は 4 および 37 °C よりも 12、15、17、20、および 22 °C で高く、17、20、および 22 °C では Crx+ 細胞の割合が高いことがわかりました。ははるかに高かった(図4c)。したがって、保存温度の好ましい範囲は 17 ± 5 °C であり、最適温度は 17 ～ 22 °C でした。

Optisol に 17 °C で 4 日間保存した網膜の細胞生存率と遺伝子発現を調べました。保存された網膜の細胞生存率は95％を超え、培養中の対照網膜の細胞生存率と同様でした（図4d）。保存された網膜におけるChx10およびCrxのmRNAレベルは、培養中の対照網膜におけるものと同等でした（図4e）。さらに、Optisol 中で 17 °C で 7 日間保存された網膜の Chx10 および Crx の mRNA レベルは、培養中のコントロール網膜の mRNA レベルと同等でした。これらの結果は、17 °C の Optisol 中での非凍結保存が網膜組織にとって最適な条件であることを実証しました。

17℃で保存した網膜組織の状態を解析しました。保存前のコントロール網膜（d70 + 0）、Optisol で 17 °C で 2 日間（d70 + 2）および 4 日間（d70 + 4）保存した網膜、および 37 °C で 3 日間培養して回復した網膜（d70 + 4 + 3) および 7 日間 (d70 + 4 + 7) をチミジン類似体 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) で 4 時間処理して、細胞周期の S 期の増殖細胞を標識し、組織学的検査を行いました。分析。 Ki67 の発現は、保存前の対照網膜と 17 °C で保存された網膜の両方で検出されました (図 4f、d70 + 2 および d70 + 4)。対照的に、17℃で保存した網膜ではEdU + 細胞は検出されず（図4f、g、d70 + 2およびd70 + 4）、これは保存された網膜前駆細胞がS期に入る前に停止したことを示しています。重要なことに、EdU取り込みは回復培養中に上方制御され、増殖能力が可逆的であることを示しました（図4f、gおよび補足図4c、d）。切断されたカスパーゼ-3+細胞（アポトーシス細胞）の数は、保存された網膜ではわずかに多かったものの、回復された網膜（d70 + 4 + 3およびd70 + 4 + 7）の数は、対照網膜の数と同様でした（補足）図4c)。

室温不凍保存法（以下、RT保存法）とリングPCR検査を組み合わせて、以下のような3D網膜の解剖（プロセス5）のためのQC手法を開発しました。各 3D 網膜からのキャップとリング、(2) RT 保存法による 17 °C でのキャップの保存、(3) 合格および不合格のリングを選択するためのリング PCR テスト、(4) に対応するキャップの除外網膜シート（最終製品）を選択するための失敗したリング、および（5）移植用の網膜シートの出荷（図4h）。

網膜シートの in vivo 腫瘍形成性研究は、免疫不全ヌードラットにおける網膜下移植によって実施されました。網膜シートは iPSC-Q 細胞から生成され、RT 保存法によって 3 ～ 4 日間保存されました。免疫不全ヌードラットを無傷群（n = 8）、偽手術群（n = 12）、移植群（n = 21）に分け、後者群のラットには網膜下空間に 1 枚の網膜シートを網膜下移植しました（n = 21）。補足図5a〜f）。移植された各網膜シート（グラフト）は、眼底画像化および光干渉断層撮影（OCT）分析によって確認されたように、網膜下腔に適切に配置されていました（補足図5b）。

移植されたラットは、移植後最大78週間の観察期間中、無傷または偽手術されたラットと比較して、体重、生存率、および臨床徴候に異常を示さなかった（図5a、b）。

腫瘍形成性研究におけるヌードラットの体重の時間経過 (a) とカプラン・マイヤー生存曲線 (b)。無傷: 手術なしの対照ヌードラット (n = 4)。偽：ビヒクル対照を網膜下に注射した対照ヌードラット（n = 4）。移植: 単一の iPSC-Q 由来網膜シートを網膜下に移植したヌードラット (n = 4)。データは平均値±標準誤差として表示されます。 c、d 移植後13、26、52、および78週間の移植された眼切片のHE染色。スケールバー: 100 μm。 e – h ヒト核マーカー、網膜マーカー、および Ki67 に対する移植された眼切片の免疫染色。スケールバー: 20 μm。 e HuNu (緑)、Recoverin (赤)、Chx10 (白)、および DAPI (青) の免疫染色。 f ヒト Ku80 (緑)、Ki67 (赤)、および DAPI (青) の免疫染色。 g ヒト Ku80 (緑色)、Ki67 (赤色)、および DAPI (青色) に対する抗体を用いた移植片 (52 週間) の免疫染色の高倍率画像。矢印は Ki67+ および Ku80+ 細胞を示します。 h Ku80+ ヒト細胞中の Ki67+ および Ku80+ 細胞の割合。データは平均値として表示されます。 INL 内核層。

移植後 13、26、52、および 78 週間での移植片の組織病理学的分析では、核異型などの増殖性または悪性の特徴は明らかになりませんでした (図 5c、d)。次に、移植片の IHC 分析が行われました（図 5e-h）。ヒト細胞（Ku80+）中の増殖ヒト細胞（Ki67+およびKu80+）の割合は各時点で1％未満であり、移植片細胞の増殖が非常に限られていることを示しています（図5f、g、h）52、53。移植細胞は、光受容体（Recoverin+およびHuNu+）および双極細胞（Chx10+およびHuNu+）に分化することが判明した（図5e）。具体的には、iPSC-Q 由来の網膜シートは、異種移植条件下でも移植後 1.5 年以上で生着しました。

この研究では、iPSC-Q 由来網膜シートに関連する腫瘍形成性やその他の副作用は観察されませんでした。

保存された網膜シートが高度に変性した状態で生着し、成熟した光受容体に分化できるかどうかを調べるために、変異ヒトロドプシン導入遺伝子を保有する末期網膜変性モデルヌードラット（SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav ヌードラット）を用いた移植研究を実施しました。、以下、RD-ヌードラット）54,55。 RT 保存法で 3 ～ 4 日間保存した iPSC 由来網膜シートを、20 ～ 30 週齢の RD ヌードラットの網膜下に移植しました。移植後24〜44週間で、PKCalpha +およびRecoverin +宿主/ラット双極細胞はまだ存在していましたが、宿主/ラットの光受容体はこの段階でほぼ完全に変性していました（図6aおよび補足図6a、対照領域）。 Recoverin + および Ku80 + ヒト光受容体は、重度に変性したラット網膜に生着し、光受容体のロゼット構造を形成しました（図6a'および補足図6b、c、d）。これは以前の研究と一致しています8、35、36、39。

a-j' iPSC-S17 由来網膜シートを移植したラット眼の免疫染色。網膜シートをRDヌードラットの網膜下腔に移植した。ラット網膜は、移植後263日(分化開始後341日)で固定された。 a、a' ヒト Ku80 (緑)、Recoverin (赤)、および PKCalpha (白) の免疫染色。コントロールの非移植領域 (a)。生着領域(a')。 (a) の矢印: ヒト Ku80-、Recoverin+、および PKCalpha+ ラット双極細胞。 b–b」ヒト Ku80 (緑)、S-アレスチン (赤)、およびコーンアレスチン (白) の免疫染色。(b) の四角で囲まれた領域は (b') に対応します。(b') の高倍率およびそれ以上の倍率(b)にあります。 c – h' 光受容体マーカーの免疫染色。 (c、c') の NRL (緑)、Recoverin (赤)、および RXRG (白)。 (d) の S-オプシン (緑) と L/M-オプシン (赤)。 (e, e') の GNAT1 (緑) と PRPH2 (赤)。 (f) の GNAT2 (緑) と PNA (赤)。 (g-g") のヒト Ku80 (緑)、シナプトフィジン (赤)、および PKCalpha (白)。(g'、g") の矢印: 核空間のないシナプトフィジン陽性神経突起。 (h, h') のヒト Ku80 (緑)、カルビンディン (赤)、および S-アレスチン (白)。 (h') の矢印: カルビンジン陽性神経突起。 i, i' (i, i') のヒト Ku80 (緑)、Recoverin (赤)、および PKCalpha (白) について免疫染色された Z スタックの最大投影画像。ヒト Ku80- および PKCalpha+ 双極細胞は、ヒト Ku80+ および Recoverin+ 光受容体の近くに位置していることに注意してください (矢印)。 j、j' CtBP2 (緑)、LRIT3 (赤)、および PKCalpha (白) で染色された Z スタックの最大投影画像。 (j') の高倍率。光受容体シナプスマーカー CtBP2 および LRIT3 が PKCalpha+ 桿体双極細胞の神経突起近くに発現していることに注目してください。 DAPI 染色 (青) (a、a'、b–b"、c、d、e、e'、f、g、g'、h、i、j、j')。スケールバー: 100 μm ( a、a'、b)、(b'、b"、c–j) では 10 μm、(j') では 1 μm。 INL内核層、GCL神経節細胞層。

さらに、桿体、錐体、外節（OS）、外網状層（OPL）、およびシナプスマーカーの発現によって、移植された光受容体の成熟を調べました。光受容体ロゼットには、S-アレスチン+桿体光受容体と錐体-アレスチン+錐体光受容体の両方が含まれていました（図6b、b'、b''）。光受容体ロゼットには、NRL+桿体前駆体、RXRG+錐体前駆体、およびS-アレスチン陽性のいくつかの成熟錐体光受容体も含まれていました。オプシンおよびL / M-オプシン（図6c、c'、d）光受容体ロゼットの桿体および錐体は、光伝達マーカー（GNAT1およびGNAT2）およびOSマーカー（PRPH2およびPNA）について陽性であり、桿体および錐体が成熟したことを示しているOS様構造を形成するために（図6e、e'、f）。シナプトフィジン+神経突起とカルビンジン+水平細胞はヒト光受容体ロゼットの周囲に存在し、OPL様構造が形成されたことを示しています（図6g、g'、g''、 h、h'、矢印)。より高い倍率の画像は、Recoverin + および Ku80 + ヒト光受容体が PKCalpha + および Ku80 - 宿主/ラット双極細胞と直接接触していることを示しました（図 6i、i'、矢印）。また、PKCalpha +双極性樹状突起の先端で、光受容体シナプス前マーカーCtBP2（Ribeye）およびLRIT3の発現も観察しました（図6j、j'）。これらの結果は、保存された網膜シートが重度のRDモデル免疫不全ラットに生着し、OS様およびOPL様構造を有する成熟光受容体に分化することを実証した。

網膜シートの光応答性を実証するために、マルチ電極アレイ (MEA) を使用して ex vivo 電気生理学的アッセイを実行しました。 3日間のRT保存後、分化81〜95日目のiPSC-S17由来網膜シートを、20〜30週齢のRDヌードラット12匹の網膜下腔に移植した。非移植眼を年齢を一致させた対照として使用した。以前に記載されているように、網膜神経節細胞 (RGC) 由来のスパイク数と RGC 光応答を評価するために、移植後 8 ～ 9 か月後にラットを ex vivo MEA 分析に供しました 36,56。 3 段階の強度（弱、中、強）の光刺激を与え、代謝型グルタミン酸受容体（mGluR6）阻害剤 L-AP4 添加前（Before）、L-AP4 添加後（L-AP4）の 3 条件で電気生理学的記録を行いました。 AP4）、およびL-AP4のウォッシュアウト後（ウォッシュアウト後）（図7a、b）。生着領域の長さは約 1.0 ～ 2.0 mm でした (図 7b、赤線)。生着領域を電極上に取り付けた。 RGCスパイク数の刺激周辺時間ヒストグラムは、光刺激誘発性RGCスパイクが移植された網膜で検出されたことを示唆しました（図7c、上）。代表的な記録 (図 7c、ボックスおよび図 7d) では、光刺激の開始後に RGC スパイク数の増加が観察されました (図 7d、前)。 L-AP4の添加により、光刺激誘発性のRGCスパイクが減衰した（図7c、d、L-AP4）。 L-AP4のウォッシュアウト後、光刺激誘発性RGCスパイクは、応答性が向上して再び現れました（図7d、ウォッシュアウト後）。対照的に、非移植対照網膜では、光刺激誘発性のRGCスパイクはほとんど検出されませんでした（図7c、d、下）。これらの結果は、移植されたラット網膜におけるRGC光応答が移植されたヒト網膜シートに由来し、移植された光受容体から双極細胞へのシナプス伝達に依存していることを示した。同様のRGC光反応は、RT保存後にiPSC-Q由来の網膜シートを移植した13眼中2眼で明らかでした（補足図7a、b）。 4日間のRT保存後に移植されたiPSC網膜シートでさえ、RGC光反応を示しました（および補足図7c、d）。

MEAを使用して移植されたiPSC網膜の光反応を評価するex vivo電気生理学アッセイのスキーム。 iPSC-S17由来の網膜シートをRDヌードラットの網膜下腔に移植しました。移植されたラット網膜と移植されていないラット網膜は、電気生理学的記録のために MEA 電極に取り付けられました。記録中、異なる強度（弱、中、強）で光刺激を与え、ラット網膜をエイムズ培地中でインキュベートした後（Before）、L-AP4 を添加（L-AP4）し、L-AP4 を洗い流しました。 -AP4 (ウォッシュアウト後)。 b – d MEA分析の代表的な結果。 (b) MEA に取り付けられた RD ヌードラット網膜の微分干渉コントラスト (DIC) 画像。生着領域は赤い点線で示されます。スケールバー: 1 mm。 c、d 強い光刺激（12.84 logフォトン/cm2/s）中のRGCスパイク数を調べるための刺激周辺時間ヒストグラム。 X 軸と Y 軸は、それぞれ時間と平均 RGC スパイク数を表します。 iPSC-S17由来網膜シートを移植したラット網膜（移植後、上）と非移植ラット網膜（非移植、下）の3つの条件（Before、L-AP4、Washout後）における記録データを示します。複数の電極記録データを (c) に示し、代表的なデータ (c の赤いボックス) を (d) に示します。 (c、d) の黄色のボックス: 光刺激。 (d) の赤い矢印: 光刺激の開始タイミング。 e RGC 光応答確率。対照の非移植ラット網膜（対照；n = 12）およびiPSC-S17由来網膜シート移植ラット網膜（移植；n = 12）をMEA分析に供し、光刺激に対するRGC応答を評価した。点と棒は、収集されたデータのサンプル (記録されたラット網膜) ごとの概要を示します。ドット: 統計モデリング (マルコフ連鎖モンテカルロサンプリングによるベイズ統計推論) によって推定された RGC 光応答確率。バー: 89% 信頼区間。

網膜シートの機能的可能性をさらに確認するために、非移植網膜（対照）および移植網膜におけるＲＧＣ光応答の確率を比較した。記録された RGC 数当たりの光応答性スパイクを伴う RGC 数 (RGC 光応答確率) は、記載されているようにベイズ統計的推論を使用して推定されました 56。非移植ラット網膜では、弱い、中程度、および強い光刺激に対して強いRGC光応答がほとんど検出されませんでした（図7e、対照および前;12ラット網膜で光応答0、0％）。 iPSC-S17由来の網膜シートを移植したラット網膜では、中程度から強い光刺激に対して、平均応答確率>0.25の強力なRGC光応答が2つのラット網膜で観察されました（図7e、移植前と移植前、2つの光応答）ラット網膜 12 個、17%)。検出されたRGC光応答は、L-AP4の存在下で減衰を示し（図7e、移植およびL-AP4）、L-AP4が洗い流された後に再び出現したため（図7e、移植および洗い流し後）、主にONタイプでした。。以前の研究と一致して、RGC光応答がL-AP4ウォッシュアウト後に強化されたことに注意してください（図7e、移植およびウォッシュアウト後対移植および移植前）。 L-AP4ウォッシュアウト後、弱い光刺激では3つの移植網膜でRGC光反応が観察され、中程度から強い光刺激では6つの移植網膜でRGC光反応が観察されました（図7e、移植後およびウォッシュアウト後。12個のラット網膜、50個のラット網膜で6個の光反応） %)。これらの結果は、RT保存後に移植されたiPSC網膜シートがRGC光応答機能を示したことを実証しました（移植されたラット網膜12匹で光反応6回[50％]、対照ラット網膜12匹で光反応0回[0％]）（図7e）。。

興味深いことに、分化81〜83日（n = 7）および90〜95日（n = 5）に移植された網膜シートではRGC光反応が観察され、約80日と約90日の網膜シートの両方に改善の可能性があることが示されました。網膜変性モデルラットにおける光反応と、有効性の分化日数の許容範囲が広い可能性があることがわかりました（補足図8a）。さらに、移植された眼のRGC光反応は雄と雌のRDヌードラットの両方で観察され、網膜シート移植が雄と雌の両方の動物でRGC光反応を強化したことを示しました（補足図8b）。

まとめると、有効性研究は、17℃で3〜4日間保存したiPSC由来の網膜シートが、重度に変性したRDヌードラット網膜に生着して成熟し、exで測定されたRGC光応答機能を示す可能性があることを実証しました。生体内電気生理学アッセイ。網膜シートに関するこれらの安全性と有効性の研究により、QC および RT 保存方法が移植可能な網膜シートの生成に合理的であることが実証されました（補足図 9）。

自己組織化幹細胞培養技術により、ディッシュ内での 3D 組織およびオルガノイドの生成が可能になります1。自己組織化組織/オルガノイド移植は、網膜変性における再生医療にとって魅力的なアプローチです。これまでの研究では、hPSC 網膜シートが末期光受容体変性モデル齧歯類および非ヒト霊長類に 0.5 ～ 2 年間生着されることが示されています 8,35,36,37,39,57。組織/オルガノイド移植に残された重要な技術は、QC 戦略と保存方法でした。この研究では、hPSC 由来網膜シートの QC 戦略を開発しました。培養中の網膜組織は、顕微鏡下で容易に識別できる独特の形態学的構造を自己形成するため、網膜シートを解剖することができます。網膜組織の選択およびオフターゲット組織の回避における起こり得るエラーを排除するために、我々は主要なオフターゲット組織を特徴付け、リングPCR検査を開発した。大きく連続した神経上皮構造を持つ網膜組織は、同様の遺伝子発現パターンを持つ内側中央シート (キャップ) と外周シート (リング) の 2 つの組織シートに分割できます。したがって、リングの qPCR 分析を使用して、対応するキャップ内の遺伝子発現を推定できます。リング PCR 検査は完了までに 1 ～ 2 日を必要とするため、網膜シートを少なくとも 3 ～ 4 日間保存するための RT 保存方法を開発しました。 QC 戦略と RT 保存法の理論的根拠を実証するために、我々は in vivo 腫瘍形成性と前臨床有効性研究を実施しました。腫瘍形成性の研究では、iPSC 由来網膜シートに関連する腫瘍やその他の副作用は観察されませんでした。前臨床有効性研究では、保存された網膜シートが重度の変性状態で生着して成熟する可能性があり、生体外電気生理学アッセイで測定された光応答機能を示すことが実証されました。これらの前臨床研究は、網膜変性に対する iPSC 由来網膜シート移植の概念を裏付けています。

現在および過去の研究 5,6,7,8,27,33,34,35,36,37,38,39 に基づいて、神戸市立眼科病院は、iPSC 由来網膜シートを使用した限られた数の患者を対象とした臨床研究を申請しました。網膜色素変性症。 2020年6月に厚生労働省の厚生科学審議会において臨床研究計画が承認され、臨床研究が開始されました（治験ID：jRCTa050200027）。住友製薬は臨床グレードの製造プロセスを開発し、臨床グレードの同種iPSC由来網膜シートを生成しました。 iPSC網膜シートは2020年から2021年にかけて2人の患者に移植された。

本研究は、高効率かつ堅牢な自己組織化培養技術に基づいています。 SFEBq、BMP、プレコンディショニング、および誘導逆転法の組み合わせにより、大きな連続神経上皮を含む網膜組織生成のための堅牢な自己組織化 3D 分化培養が可能になります 7,8。この大きな連続神経上皮構造は接線方向に 1 ～ 3 mm のサイズを有しており、顕微鏡下での識別が容易であり、キャップとリングを解剖することが可能でした。連続神経上皮を有する自己組織化網膜組織は再現性よく分化し、当社のプロトコールまたは異なる培養プロトコールを使用して、複数の hPSC 株からの Crx+ 光受容体前駆細胞層と Chx10+ 網膜前駆細胞層を含む多層構造を形成しました 6、12、13、14、18、19、22。おそらく固有の胚発生プログラムに基づいた 3D 自己組織化のこの機能は、品質が管理された網膜シートを堅牢に生成するための中核技術です。

本研究における QC 法の特徴の 1 つは、キャップの品質をチェックするためにリングを解剖して分析することでした。このキャップアンドリングアプローチは、皮質、海馬、下垂体、腸オルガノイドなどの連続上皮を持つ他のオルガノイドにも利用できる可能性があります40、58、59、60。微小組織の手作業による解剖は、初代神経前駆細胞培養にアフリカツメガエルの初期胚やマウスの発育中の脳を使用する研究において広く行われている実験手順である 33,39 が、将来の iPSC 由来網膜シートの製造には解剖プロセスの自動化と機械化が重要となる。

リングの品質を調べるための QC テストの候補の 1 つは qPCR 分析であり、その他の候補は IHC 分析、フローサイトメトリー、遺伝子チップ分析 (マイクロアレイ)、RNA-seq、および単一細胞分析でした。この研究では qPCR を選択しました。その理由は、比較的短期間で多くのサンプルを検査するハイスループットアッセイが可能であり、感度が高く、技術的に簡単であるためです 48。他のQC検定にも得意分野がありました。 RNA-seq アプローチを用いた最近の研究により、Matrigel 法を用いた網膜分化培養中の Six6 陰性オフターゲット細胞には、Emx2 陽性細胞や HoxB2 陽性細胞を含む複数の神経細胞が含まれることが明らかになりました 61。さらに、単一細胞 RNA-seq などの単一細胞解析は強力な技術であり、いくつかのグループが先駆的な研究を報告しています 13,62,63,64,65。一方、イメージング技術やディープラーニング技術などの計算機画像処理は、非破壊 QC 検査の開発に有望なアプローチです。今後は、単一細胞解析やイメージング技術の研究を進め、自己組織化3D網膜の質をさらに調査していきたいと考えています。

凍結保存は世界的に供給するには魅力的なアプローチですが、凍結保存された網膜シートは生着障害を示しました。そこで、非凍結保存法を開発する必要があり、その結果、網膜シートの保存に最適な温度は室温（17±5℃）に近い温度であることが分かりました。肝組織については室温での保存が報告されており 49、我々の研究では、網膜組織などの神経組織には室温に近い温度が適していることが実証されました。 4 °C 付近の低温は、おそらく 4 °C での異常な細胞内代謝によって組織に損傷を引き起こしました49。 37℃、5% CO2下での培養は細胞増殖に適していましたが、自己組織化培養中に網膜シートの形態が変化しました。 17 ± 5 °C での RT 保存により、網膜シートの形態を維持できます。 RT 保存中、網膜組織は S 期への移行を停止し、この保存条件下では増殖が停止する可能性があります。 RT 保存は、RPE および網膜組織について最近報告されました 66,67。我々はRT保存法を開発し、RT保存条件下で網膜シートの1.5年間の腫瘍原性試験を含む移植研究を実施した。

臨床応用に向けて、リング PCR 検査と RT 保存法を使用して生成した iPSC 網膜シートの in vivo 腫瘍形成性と有効性を評価しました。腫瘍形成性の研究では、腫瘍や網膜シートに関連するその他の副作用は観察されませんでした。 RT 保存された iPSC 網膜シートは RD ヌードラットに生着し、成熟して光受容体ロゼットを形成しました。同様の光受容体のロゼット構造は、ラットへのヒトドナー由来の胎児網膜組織移植でも観察されました68。宿主RPE側のロゼットにあるヒトiPSC光受容体の半分は宿主/ラット双極細胞から遠く離れていましたが、宿主RGC側のロゼットにあるヒトiPSC光受容体の残りの半分は宿主/ラット双極細胞に接触することができました。生着されたiPSC光受容体はin vivoで成熟し、ロゼットの内側頂端面にOS様構造を形成し、双極細胞および水平細胞に隣接する外側基底部に光受容体シナプスマーカー発現を伴うOPL様構造を形成した。電子顕微鏡検査は、移植された光受容体と宿主双極細胞の間のシナプス接続を実証する鍵となるでしょう。重要なのは、iPSC 網膜移植の 50% が、ex vivo MEA 記録によってモニターされた光反応を示したことです。この率は、RT 保存を行わない新鮮な iPSC 網膜の移植に関する以前の結果 (移植されたラットの眼 7 個で 4 回の光反応、57%) に匹敵しました 36。これらの観察は、末期網膜変性状態で移植されたRT保存iPSC網膜シートが生着して成熟光受容体に分化し、RGC光応答を示すことを実証した。将来の研究では、脳内の RT 保存網膜シートの光反応性と行動レベルを調査することが興味深いでしょう 37。

将来の多数の患者への臨床応用に向けては、さらなる前臨床研究が鍵となります。中でも、網膜シートの普及を可能にするためには、外科手術、移植器具、免疫抑制プロトコルを開発するための大動物研究が重要です。自己組織化幹細胞培養技術に基づいて、医療における組織・オルガノイド治療の実現が進められています。

2 つのヒト iPSC 株、iPSC-LPF11 および iPSC-S17 は、住友製薬によってセンダイウイルスベクターを使用して末梢血細胞から樹立されました8。 iPSC-QHJI01s04 系統 (iPSC-Q) は、京都大学 iPS 細胞研究所 (CiRA) が主催する iPSC ストックプロジェクトによって確立され、京都大学から提供されました 69,70。京都大学で樹立され、Cellular Technology Limited (http://www.immunospot.com/) から購入した ePBMC(R) に由来する iPSC-1231A3 系統は、京都大学から提供されました 41。臨床グレードのヒト iPSC を使用した実験プロトコルは、日本の住友製薬株式会社の研究倫理委員会によって承認されました。

フィーダーフリー hPSC 培養、SFEBq、プレコンディショニング、d0-SAG、BMP、および誘導反転培養法は、記載されているように 6、7、8、41 わずかに変更を加えて実行されました。プロセス 1 (維持培養) では、公開されているプロトコール 41 に従って、若干の変更を加えた 8 に従って、StemFit 培地 (味の素) 中の LM511-E8 マトリックス (Nippi) 上でヒト iPSC を維持しました。細胞が 70 ～ 80% コンフルエンスに達するまで、培地を 1 ～ 2 日ごとに交換しました。 TrypLE Select Enzyme (Thermo Fisher Scientific) を使用して iPSC を継代し、穏やかなピペッティングによって単一細胞に解離させました。解離した iPSC を 700 ～ 1700 細胞/cm2 の密度で播種し、10 µM Y-27632 (Wako) を含む StemFit 培地を含む LM511-E8 マトリックスコート 6 ウェル培養プレート (Iwake) で培養しました8。分化の前に、プレコンディショニングステップとして、iPSC を SB431542 (SB; Wako) および/またはスムージングアゴニスト (SAG; Enzo Biochem) で処理しました。

プロセス 2 (網膜分化) では、hPSC を TrypLE Select Enzyme で 37 °C で 4 ～ 7 分間処理し、穏やかなピペッティングによって単一細胞に解離させました。解離した iPSC は、V 底ウェルを備えた低細胞接着性 96 ウェルプレート (Sumilon PrimeSurface プレート、住友ベークライト) を使用して、Y-27632 および SAG を含む分化培地 (gfCDM+KSR) 中で迅速に再凝集されました (d0-SAG 法)。分化培地は、10% KSR を添加した gfCDM でしたが、gfCDM 単独は、45% の Iscove 改変ダルベッコ培地 (Gibco)、45% Hams F12 (Gibco)、Glutamax、1% 化学的に定義された脂質濃縮物 (Gibco)、および 450 μM モノチオグリセロール (シグマアルドリッチ）。 SFEBq培養開始日を0日目と定義した。3日目に、組換えヒトBMP4（R&D Systems）を1.5nM（55ng/ml）で添加した7。その後、培地を 3 ～ 4 日ごとに交換して、未熟な網膜組織を生成しました。

工程3（誘導反転培養）では、iPS細胞から作製した未熟網膜組織を以下の2段階の誘導反転培養に供した。誘導培養では、14 ～ 18 日目の細胞凝集体を 96 ウェルプレートから 90 mm 非細胞接着シャーレ（住友ベークライト、90 mm ディッシュあたり約 32 ～ 48 個）に移し、3 日間培養しました。 1% N2 サプリメント (Gibco)、3 μM CHIR99021 (GSK3 阻害剤; Wako)、および 5 μM SU5402 (FGFR 阻害剤; Wako) を含む DMEM/F12-Glutamax 培地 (Gibco) 中で数日間培養しました。逆転培養（プロセス３）および成熟培養（プロセス４）では、細胞凝集体を、記載されているように網膜成熟培地中で培養した（Nukaya et al. WO2019017492A1、WO2019054514A1）。培地を３日または４日ごとに交換して、３Ｄ網膜を取得した。浮遊細胞凝集体は、倒立顕微鏡 (Keyence BZ-X810、Nikon Eclipse-Ti、または Olympus IX83) を使用して分析されました。

連続した重層神経上皮組織を含む各細胞凝集体について、キャップとリングの剥離を行った（工程５）。神経上皮組織の中央部分は、記載されているように顕微鏡下で細胞凝集体から切り取られました39。解剖した内中心神経上皮組織シートをキャップとして回収した。同時に細胞塊から周囲の神経上皮組織の外周部分を切り出し、リングとして採取した。得られたキャップとリングは、それぞれ RT 保存法とリング qPCR テストに供されました。リングPCR検査に合格したキャップは移植用網膜シートとして使用されました。

リングおよび他の組織サンプルを、1% 2-メルカプトエタノールを含むバッファー RLT (Qiagen) で溶解し、RNeasy Micro Kit (Qiagen) を使用して全 RNA を抽出および精製しました。全RNAを逆転写し、メーカーの指示に従ってStepOne PlusリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)またはBiomark HD(Fluidigm)を使用してqPCRを行った。各遺伝子の Ct 値に基づいて、個々のキャップまたはリングの Z スコアが計算されました。データは、R/Bioconductor パッケージ gplots の heatmap.2 関数を使用してヒートマップとして視覚化されました。 PCA は、R 基本パッケージの prcomp 関数を使用して実行されました。 PCA の結果は、R パッケージ ggplot2 を使用して視覚化されました。次の qPCR プライマー (TaqMan プローブ) は Applied Biosystems, Inc. から購入し、qPCR 分析に使用しました: GAPDH (Hs02758991_g1)、ACTB (Hs01060665_g1)、Sox2 (Hs01053049_s1)、Pax6 (Hs00240871_m1)、Rx (Hs0042945) 9_m1)、Chx10 (Hs01584047_m1) )、Recoverin (Hs00610056_m1)、Blimp1 (Hs00153357_m1)、NRL (Hs00172997_m1)、Crx (Hs00230899_m1)、MITF (Hs01117294_m1)、Aqp1 (Hs01028916_m1)、Emx2 ( Hs00244574_m1)、HoxB2 (Hs01911167_s1)、および Lin28a (Hs00702808_s1)。

細胞凝集体中の切除組織を、1% 2-メルカプトエタノールを含むBuffer RLT (Qiagen)で溶解し、RNeasy Micro Kit (Qiagen)を使用して全RNAを抽出および精製した。 GeneChip アレイを使用したマイクロアレイ分析は、クラボウ (日本、大阪) によって実行されました。簡単に説明すると、T7 オリゴ d(T) プライマー (Affymetrix) を使用して、全 RNA を cDNA に逆転写しました。次に、ビオチン標識 cRNA を合成し、T7 RNA ポリメラーゼ (Affymetrix) を使用した第 2 鎖 cDNA テンプレートの in vitro 転写によって増幅しました。標識されたcRNAを精製および断片化し、GeneChip(登録商標)Human Genome U133 Plus2.0アレイ(Affymetrix)にロードし、製造業者のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。 GeneChip アレイからの生の強度データは、GeneChip オペレーティングソフトウェア (Affymetrix) を使用して分析されました。データは対数変換され、各遺伝子の logFC が計算されました。 logFC データは、R/Bioconductor パッケージ gplots の heatmap.2 関数を使用してヒートマップとして視覚化されました。

キャップとリングを 3D 網膜から切り出しました。リングがリング PCR テストに合格したキャップを scPCR 分析に供しました。パパイン（Wako）を使用してキャップを単一細胞に解離し、その後単一細胞を分離するために C1 プリアンプ IFC（10 ～ 17 μm、Fluidigm）にロードしました。遺伝子の前増幅は、製造業者の指示に従ってC1機器(Fluidigm)で実施した。各細胞から事前に増幅された cDNA は、TaqMan アッセイを備えた Biomark HD 機器 (Fluidigm) を使用してさらに増幅されました。

細胞凝集塊と組織シート（キャップ）を 1.5 mL または 15 mL チューブに移しました。培養上清を洗い流した後、保存液を加え、チューブを 4、12、15、17、20、22、および 37 °C に設定したインキュベーターに置きました。温度検証のため、一部の実験ではインキュベーターの温度が温度ロガーによって監視されました。保存液の候補としては、Optisol-GS (Bausch & Lomb)、平衡塩類溶液 (BSS) (Gibco)、Belzer UW Cold Storage Solution (Bridge to Life)、細胞培養液を使用しました。キャップを室温で保存するために、Optisol 中のキャップを含む各 1.5 mL チューブを、17 °C に設定したクールインキュベーター (三菱電機エンジニアリング) に置きました。リング PCR 検査を含む QC 検査に合格したキャップが採取され、移植に使用されました。

３Ｄ網膜から切り出した組織シートを、パパイン（Ｗａｋｏ）を用いて単一細胞に解離した。遠心分離して上清を除去した後、解離した細胞を新鮮な培地に懸濁しました。全細胞と死細胞をアクリジンオレンジと DAPI で染色し、生細胞の数とパーセンテージを NucleoCounter® NC-200 (ChemoMetec) を使用して測定しました。

すべての動物実験プロトコルは、理化学研究所生命システム動態研究センター（BDR）の動物管理委員会によって承認され、視覚および眼科研究協会の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明に従って実施されました。 SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav ヌードラット (RD ヌードラット) は、Rat Resource and Research Center から入手しました 54,55。ラットの網膜下腔への移植は、記載されているように実行されました 36。 iPSC網膜シートを移植した雄と雌のRDヌードラットは、生後13.5〜15か月（移植後8〜10.5か月）でMEA記録に使用されました。 MEA 記録は、説明されているように USB-MEA60-Up システム (マルチチャネルシステム) を使用して実行されました 36,56。簡単に言うと、RD ヌードラットを使用前に 1 ～ 3 日間暗順応させました。ラットを麻酔し、イソフルランまたはセボフルランを過剰に吸入して屠殺した。次に、彼らのアイカップを、700 nm をピークとする薄暗い赤色光の下で採取し、暗所の酸素添加エイムズ培地 (Sigma-Aldrich) に置きました。網膜をアイカップから慎重に分離し、残った硝子体を除去しました。網膜は RGC 側を下にして取り付けました。生着領域は、電極の中心にある点状の外観によって認識されました。さまざまな強度（弱：10.56 log フォトン/cm2/s、中：12.16 log フォトン/cm2/s、強：12.84 log フォトン/cm2/s）で 10 ms および 1 秒の持続時間の全視野光刺激を生成しました。白色LED（NSPW500C；日亜化学工業株式会社）。各刺激強度と持続時間の組み合わせごとに 3 回の反復で構成される各刺激セットを、L-AP4 の添加前 (Before)、10 μM L-AP4 (L-AP4、mGluR6 ブロッカー、Wako) の存在下で繰り返しました。 L-AP4のウォッシュアウト後（ウォッシュアウト後）。 MEA 記録の最後に超強力な刺激 (15.48 log 光子/cm2/s) を加えて、網膜の細胞生存率を確認しました。 MEA データは、フィルタリングせずに 20 kHz のサンプリングレートで収集されました。記録されたスパイクは、小規模な変更を加えた Spike 2 (バージョン 7.2; CED) の自動テンプレート形成およびスパイクマッチングアルゴリズムを使用して、オフラインで並べ替えられ、RGC スパイクがカウントされました 56。 RGC 光応答は、刺激の開始および/または終了に対してスパイク周波数が 2 倍増加するものとして定義されました。平均 RGC スパイク数と平均 RGC 光応答確率 (記録された RGC 数あたりの光応答スパイクのある RGC 数) は、記載されているように各サンプルで検出されたすべての RGC から計算されました 36,56。

動物を用いた in vivo 腫瘍原性研究は、財団法人生物医学研究基盤機構 (FBRI) の治験審査委員会、FBRI の動物実験委員会、および理化学研究所 BDR の動物管理委員会によって承認されました。理研BDRにて網膜下移植が実施されました。この研究では、同じケージで飼育されているラット間の争いを減らすために、雌のヌードラットが使用されました71。移植には生後６週齢の雌性ヌードラット（F344/NJcl-rnu/rnuラット；日本クレア）を使用し、観察期間中の全身状態観察および体重測定を行った。ラットの網膜下移植の外科的ストレスは、偽手術された目で評価されました（補足図5e、f）。眼底イメージングおよびOCT分析は、RS-3000 Advance (Nidek)およびMicron IVおよびOCT (Phoenix Research labs)を使用して、製造元の指示に従って実行されました。剖検後、眼球をSUPERFIX（KY-500、クラボウジャパン）中で4℃で固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトームで3μmの厚さにスライスした。 5 つの切片に 1 つが HE 染色と組織病理学的分析に使用され、他の切片は免疫組織化学に使用されました。

IHC は記載どおりに実施されました8。ＲＤヌードラットから採取した細胞凝集体および移植網膜を４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ）で固定し、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）で切片を作成して凍結切片を作製した。凍結切片およびパラフィン切片を、Target Retrieval solution (Dako) 中で、熱ベースの抗原賦活化の有無にかかわらず、105 °C で 15 分間処理しました。使用した一次抗体は次のとおりです:抗Chx10 (ヒツジ; 1:500; Exalpha)、抗Pax6 (マウス; 1:1000; BD Biosciences)、抗Rx (モルモット; 1:2000;Takara)、抗-Crx (ウサギ; 1:200;Takara)、抗 Recoverin (ウサギ; 1:500; Proteintech)、抗 RXRG (マウス; 1:500; Santa Cruz Biotechnology)、抗 NRL (ヤギ; 1:500; Proteintech) R&D Systems)、抗 Lhx2 (ウサギ; 1:500; Millipore)、抗ロドプシン (マウス; 1:1000; Sigma Aldrich)、抗 S-オプシン (ヤギ; 1:1000; Santa Cruz Biotechnology)、抗S-オプシン（ウサギ; 1:500; Santa Cruz Biotechnology）、抗 L/M-オプシン（ウサギ; 1:500; Millipore）、抗コーンアレスチン（Arrestin-3; ヤギ; 1:500; Novus）、抗 S-アレスチン (マウス; 1:500; Novus)、抗 CtBP2 (マウス; 1:500; BD Biosciences)、抗 PKCalpha (ヤギ; 1:500; R&D Systems)、抗 Ki67 (マウス; 1:500; BD Biosciences) 1:500; BD Biosciences)、抗 Aqp1 (Aquaporin1; ウサギ; 1:500; Millipore)、抗 Emx2 (ヒツジ; 1:100; R&D Systems)、抗切断カスパーゼ-3 (ウサギ; 1:200; Millipore) Cell Signaling Technology)、抗 HuNu (マウス; 1:500; Millipore)、抗ヒト Ku80 (ウサギ; 1:500; Millipore) 1:500; Cell Signaling Technology)、抗ヒト Ku80 (ヤギ; 1:500; R&D Systems)、抗 Gnat1 (ウサギ; 1:500; Santa Cruz Biotechnology)、抗 Gnat2 (ウサギ; 1:500; Santa Cruz Biotechnology)、抗 PRPH2 (マウス; 1:500; Millipore)、ピーナッツ凝集素 (PNA) (1:500; Thermo Fisher Scientific)、抗シナプトフィジン (ヤギ; 1:500; R&D Systems)、および抗 LRIT3 (ウサギ; 1 :500; ノーバス)。核の対比染色はDAPI (Nacalai)を用いて実施した。染色された切片を蛍光顕微鏡 (Keyence BZ-X810) またはレーザー走査型共焦点顕微鏡 (Olympus Fluoview FV1000D、Leica TCS SP-8、または Carl Zeiss LSM880) で分析しました。画像解析は、IMARIS (Oxford Instruments)、ImageJ (National Institutes of Health)、および Zen Blue (Carl Zeiss) イメージングソフトウェアを使用して実行されました。

EdU 標識の場合、保存前のコントロール網膜 (d70 + 0)、Optisol で 17 °C で 2 日間 (d70 + 2) および 4 日間 (d70 + 4) 保存した網膜、および 37 °C で 3 日間培養して回復した網膜日 (d70 + 4 + 3) および 7 日 (d70 + 4 + 7) をチミジン類似体 EdU で 4 時間処理しました。 EdU処理した網膜を固定し、クライオスタット(ライカ)で切片化した。網膜の切片を、メーカーのプロトコールに従って、Alexa Fluor 488標識アジド(Invitrogen)で染色した。共焦点レーザー顕微鏡を使用して画像を取得し、ImageJ ソフトウェア (国立衛生研究所) を使用して EdU 陽性細胞および DAPI 陽性核の数を計数しました。

統計分析は、R バージョン 3.6.0 (The R Foundation for Statistical Computing) を使用して実行されました。 2 グループの比較では両側スチューデント t 検定を実行し、複数グループの比較では一元配置分散分析 (ANOVA) に続いてテューキーの検定を実行しました。体重と生存率の群間の差異は、それぞれ一元配置分散分析とログランク検定によって検定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべての合理的なリクエストは上級著者によって直ちに検討され、そのリクエストが知的財産または機密保持義務の対象となるかどうかが判断されます。この研究では新しい細胞株は生成されませんでした。グラフのソースデータは補足データとして提供されます。マイクロアレイトランスクリプトームデータは、アクセッション番号 GSE197446 で入手できます。

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吉田晋ほか日本人人口の約 40% に一致するヒト人工多能性幹細胞の臨床グレード HLA ハプロバンク。医学 4、51–66.e10 (2023)。

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土肥大樹ほかパーキンソン病に対する人工多能性幹細胞由来のドーパミン作動性前駆細胞の前臨床研究。ナット。共通。 11、3369 (2020)。

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Kawamata, S.、Kanemura, H.、Sakai, N.、Takashi, M. & Go, MJ 人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来細胞産物の腫瘍原性試験の設計。Ｊ．クリン．医学。 4、159–171 (2015)。

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iPSC を提供していただいた CiRA (日本、京都) および CiRA Foundation (日本、京都) に感謝します。網膜成熟培養に関してご助言を頂いた永楽基次先生、平峰泰史、岩田美樹、田中一成、矢畑正博、真鍋幸一郎、坂東紀代子、秋丸次郎、川辺圭吾、吉田憲司、安藤聡、土田篤史、永野友一、有意義な議論のために RACMO のメンバーと協力しました。 in vivo 研究については木曽あゆみ氏、IHC 染色については金田耕平氏、解剖については石上由紀子氏に感謝します。 A.く。自己組織化幹細胞生物学の先駆者である才能ある科学者である故・笹井芳樹博士に深く感謝の意を表したいと思います。この研究は、日本医療研究開発機構 (AMED) の再生医療実現研究拠点ネットワーク (MT、SK) の支援を受けました。

These authors contributed equally: Kenji Watari, Suguru Yamasaki.

住友製薬株式会社再生・細胞医療神戸センター〒650-0047 神戸市中央区

Kenji Watari, Suguru Yamasaki, Tatsuya Kamei, Yasuyuki Kita, Masayo Fujiwara, Yoriko Hori, Anna Tanabe, Rina Hirai, Orie Terai, Osamu Ohno, Hidetaka Ohara, Tetsuya Hayama, Atsushi Ikeda, Daiki Nukaya, Keizo Matsushita, Akiyoshi Kishino, Toru Kimura & Atsushi Kuwahara

理化学研究所生命機能科学研究センター網膜再生研究チーム、〒650-0047 神戸市中央区

Suguru Yamasaki, Hung-Ya Tu, Chikako Morinaga, Take Matsuyama, Junki Sho, Keizo Matsushita, Masayo Takahashi & Michiko Mandai

公益財団法人医薬基盤研究財団細胞医療研究開発センター（〒650-0047 神戸市中央区神戸）

Masayuki Shikamura, Miyuki Nakamura & Shin Kawamata

住友製薬株式会社研究本部前臨床研究ユニット〒554-0022 大阪市此花区

Hideki Adachi & Tomoaki Tochitani

住友製薬株式会社技術研究開発部〒650-0047 神戸市中央区

Aya Nakamura, Kazuki Ueyama & Keiichi Ono

理化学研究所創薬・医療技術プラットフォームプログラム、理化学研究所科学技術イノベーションハブクラスター、〒351-0198 埼玉県

Chikako Morinaga & Michiko Mandai

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KW は、オフターゲット組織分析、リング PCR テスト、および RT 保存法に関する研究を設計し、実験を実行し、データを分析し、原稿を執筆しました。 SY は、生体内での自己組織化培養と IHC 分析の研究を設計し、実験を実施し、データを分析し、原稿を執筆しました。 HYT は電気生理学的アッセイを設計および実行し、データを分析し、原稿を執筆しました。 MS、T.Ka.、HA、TT、YK は腫瘍原性研究を設計および実施し、データを分析し、原稿を執筆しました。 AN、KU、KO、CM、TM、JS、MN、OT、OO、MF、YH、AT、RH、HO、TH、DN、KM が実験を行い、データを分析しました。 AI、MT、A.Ki.、T.Ki. プロジェクトを管理し、データを分析しました。 SK は in vivo 腫瘍原性研究を監督および設計し、データを分析し、原稿を執筆しました。 MM は、in vivo 有効性研究を考案、監督、設計し、実験を実施し、データを分析し、原稿を執筆しました。 A.く。自己組織化培養、オフターゲット組織解析、リングPCR検査、RT保存法を考案、監督、設計し、実験を実施し、データを分析し、原稿を執筆し、原稿の最終承認を行いました。

Correspondence to Atsushi Kuwahara.

この研究は、助成番号 JP21bm0204002 (MT、SK) の下で AMED から、および住友製薬株式会社 (住友) から資金提供を受けました。 KW、SY、T.Ka.、HA、TT、YK、AN、KU、KO、MF、YH、AT、RH、OT、OO、HO、TH、AI、DN、KM、A.Ki.、A .く。住友に採用されています。 T.Ki. 住友商事の取締役です。 SKは住友に対する科学コンサルティングの役割を担っている。 MT と MM は住友から研究資金を受けています。著者は特許出願の共同発明者です。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Biju B. Thomas と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Simona Chera と Eve Rogers。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

渡和利、山崎伸、Tu、HY. 他。組織移植治療のためのヒト iPSC 由来網膜シートの自己組織化、品質管理、および前臨床研究。 Commun Biol 6、164 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

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受信日: 2022 年 8 月 23 日

受理日: 2023 年 1 月 31 日

公開日: 2023 年 2 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

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